Une étude de cohorte longitudinale intensive sur les enfants et les adultes maliens ne révèle aucune preuve de l’immunité acquise contre l’infection à Plasmodium falciparum

Contexte Dans des modèles expérimentaux de paludisme humain et murin, une immunité stérilisante au stade hépatique bloquant la progression de l’infection plasmodique au stade symptomatique peut être facilement démontrée. Cependant, on ignore si les personnes vivant dans les zones endémiques du paludisme acquièrent une telle immunité. Les adultes ont été inclus dans une étude longitudinale juste avant une saison de paludisme intense. Les épisodes palustres cliniques subséquents ont été détectés par surveillance active hebdomadaire et auto-référence P falciparum asymptomatique Les infections ont été détectées par microscopie des frottis sanguins et par analyse PCR des taches de sang séché collectées toutes les semaines pendant des mois. Résultats Comme attendu, le risque de paludisme clinique a diminué avec l’augmentation du log-rank, P = Cependant, l’analyse des les différences liées à l’âge dans le risque d’infection à P. falciparum log-rank tes t, P = Conclusions Malgré des années d’exposition à une transmission intense de P falciparum, il n’y a aucune preuve d’immunité acquise et stérile à l’infection à P. falciparum dans cette population, même si l’immunité clinique au paludisme sanguin est clairement acquise. ne pas induire une protection stérile peut conduire à des idées pour développer des vaccins qui ciblent le stade hépatique chez les populations endémiques

Immunité préérythrocytaire, population endémique, Plasmodium falciparum, risque infectieux, paludisme Le paludisme à Plasmodium falciparum demeure une menace majeure pour la santé publique pour laquelle il n’existe aucun vaccin homologué Ces dernières années, le développement de vaccins prévenant ou atténuant la maladie clinique causée par le sang L’immunisation stérilisante contre l’infection à Plasmodium peut être facilement démontrée dans des modèles expérimentaux du paludisme chez l’homme et la souris , preuve d’une immunité naturellement acquise et stérilisante à l’infection par Plasmodium. P falciparum dans le milieu endémique a été moins clair L’incidence élevée de la réinfection au stade sanguin après le traitement médicamenteux chez les adultes suggère que les populations naturellement exposées n’obtiennent jamais une immunité stérilisante complète même après des années d’infections répétées et fréquentes . pour certaines protéines Plasmodium ex En outre, les résultats d’études sur le terrain portant directement sur la relation entre l’âge et le risque de réinfection par P. falciparum ont été incohérents, plusieurs études démontrant Le risque d’infection à P. falciparum diminue dans les groupes plus âgés , tandis que d’autres ne présentent aucune différence liée au vieillissement. Ces études de terrain antérieures utilisaient des études de réinfection, dans lesquelles les volontaires étaient débarrassés de toute parasitémie schémas antipaludéens avant évaluation du risque de réinfection Cette approche pourrait modifier le risque ultérieur de paludisme et l’acquisition de l’immunité naturellement acquise et risque de classer incorrectement les infections recrudescentes comme nouvelles infections De plus, dans toutes les études antérieures évaluant l’infection à P. falciparum risque entre les enfants et les adultes, l’infection au stade a été déterminée par l’examen microscopique des frottis sanguins épais, une technique relativement peu sensible qui peut conduire à une classification erronée des individus présentant une infection submicroscopique au stade sanguin comme étant «immunologiquement» immunitaire. A notre connaissance, aucune étude prospective n’a été menée sur l’infection à P. falciparum. Nous avons profité de la transmission saisonnière du P falciparum au Mali pour mener une étude longitudinale intensive du temps de la première infection à P. falciparum chez des enfants et des adultes en bonne santé qui n’avaient pas reçu récemment d’antipaludiques et qui étaient exemptes d’infection par Plasmodium par PCR avant la saison de paludisme de mois. L’objectif était de tester l’hypothèse que l’immunité à l’infection à P. falciparum est acquise par des infections répétées dans les zones d’endémie palustre.

Méthodes

Conception de l’étude et participants

De mai à décembre, une étude de cohorte observationnelle a été menée à Kalifabougou au Mali, un village rural d’environ habitants situé à km au nord-ouest de Bamako dans une région du Mali qui connaît généralement une transmission saisonnière intense de P falciparum de juillet à décembre. n’a pas participé à des études antérieures et est desservie par une seule clinique et pharmacie qui fournit le seul accès aux médicaments antipaludiques dans la région. Un échantillon aléatoire stratifié selon l’âge de la population du village a permis d’inscrire des individus en bonne santé. La taille de chaque groupe d’âge reflète la conception de cette étude en cours sur l’immunité antipaludique, qui se concentre sur les enfants plus âgés à mesure qu’ils passent de la susceptibilité au paludisme à l’immunité. Les critères d’exclusion étaient le taux d’hémoglobine. g / dL, température axillaire ≥ ° C, maladie systémique aiguë, utilisation de médicaments antipaludéens ou immunosuppresseurs au cours des derniers jours et grossesse Des épisodes palustres cliniques ont été détectés prospectivement par des visites d’auto-référence et de surveillance clinique hebdomadaire active alternant entre la clinique d’étude et le domicile des participants Tous les individus présentant des signes et symptômes de paludisme et tout parasite de Plasmodium détecté par microscopie optique ont été traités selon les directives du Programme National de Lutte contre le Paludisme au Mali La définition de recherche du paludisme était une température axillaire ≥ ≥ ° C, ≥ Au cours des visites cliniques prévues, du sang a été prélevé toutes les semaines par piqûre au doigt pour préparer des frottis sanguins et des taches de sang séchées sur du papier filtre. Des infections asymptomatiques à P. falciparum ont été détectées au microscope. examen des frottis sanguins et analyse PCR des taches de sang à la fin de la Période de surveillance Les individus trouvés positifs à la PCR pour l’infection à Plasmodium lors de l’inclusion ont été exclus de cette analyse

Détection de l’infection à P. falciparum

Pour chaque participant, une microscopie des frottis sanguins et une PCR ont été effectuées sur des échantillons sanguins dans l’ordre chronologique jusqu’à la détection de la première infection à P. falciparum. Les frottis sanguins épais ont été colorés au Giemsa et comptés contre les leucocytes et les densités de P. falciparum au nombre de parasites asexués. Chaque frottis a été évalué séparément par au moins des experts en microscopie. Pour l’analyse PCR, nous avons adapté une technique de PCR nichée précédemment décrite pour amplifier l’ADN du parasite directement à partir de taches de sang séchées conservées sur le filtre Protéine Saver. papier Whatman utilisant des amorces ciblant l’espèce humaine Plasmodium S ARN ribosomal Les échantillons positifs au plasmodium ont été identifiés seulement comme P falciparum, P malariae, ou les deux infections mixtes étant donné l’incidence négligeable d’autres espèces de Plasmodium dans la zone d’étude. un poinçon circulaire de sang séché sur du papier filtre a été ajouté à une réaction de -μL contenant des amorces μM rPLU / rPLU, du tampon PCR Phusion Blood, et du μL Phusion Blood II ADN Polymérase Finnzymes Le protocole cyclique a commencé par la lyse des cellules à ° C pendant quelques minutes, suivies de cycles d’amplification ° C pour la seconde, Pour la seconde amplification, on a ajouté μL du produit PCR de la première amplification à un volume final de réaction -μL contenant soit le μF rFAL / FFAL pour P falciparum ou μM rMAL / rMAL pour les ensembles d’amorces P malariae Tableau supplémentaire, dNTP mM, × tampon PCR GoTaq et unités GoTaq DNA Polymerase Promega L’ADN matrice a été dénaturé à ° C pendant des minutes, suivi de cycles d’amplification ° C pour minute, ° C pour minute, ° C pour minute et une extension finale à ° C pour minutes Les réactions ont été réalisées dans de bonnes plaques PCR. La détection de la bande cible a été réalisée en utilisant un DNA K LabChip sur le LabChip GX HT selon les recommandations du fabricant. Pour quantifier les infections submicroscopiques au stade sanguin et estimer la charge hépatique parasitaire définie ici comme la charge parasitaire au moment de la première infection détectable au stade sanguin, une PCR quantitative quantitative en temps réel a été réalisée sur le sang. échantillons déterminés positifs par PCR nichée L’ADNg génomique a été extrait d’un poinçon circulaire de sang séché de -mm sur du papier filtre comme décrit ailleurs Pour chaque réaction, on a ajouté μL d’ADN matrice extrait à un mélange maître -μL contenant nM rFAL Applied Biosystems En tant que contrôle de l’extraction de l’ADN, un autre ensemble de réactions en triple a été effectué en tandem en utilisant des amorces GAPDH humaines au lieu de P amorces rFAL et x Power SYBR vert PCR Master Mix Applied Biosystems Les réactions ont été effectuées en triple. Amorces spécifiques de falciparum Tableau supplémentaire Chaque plaque incluait un contrôle de matrice non ADN, un contrôle de l’ADNg humain et un contrôle de l’ADN g de P falciparum purifié Seria Des dilutions logarithmiques de l’ADN extrait des taches de sang séché sur du papier filtre de densités parasitaires connues commençant à environ parasites / μL ont été effectuées en triple pour générer des courbes standard dans lesquelles les valeurs Ct du seuil du cycle ont été tracées par rapport à la densité du parasite. fonctionne sur un système Applied Biosystems HT en utilisant les paramètres recommandés par le fabricant Les courbes d’amplification ont été évaluées avec le logiciel ABI Sequence Detection System, version Applied Biosystems

Analyses statistiques

La courbe de Kaplan-Meier a été utilisée pour estimer la probabilité de demeurer indemne de paludisme clinique et d’infection à Plasmodium dans les groupes d’âge suivants: – années, – années, – années et – ans Les personnes infectées par P. malariae ont été censurées Nous avons comparé les différences entre les groupes médians avec le test de Kruskal-Wallis. Pour les résultats continus, nous avons comparé les différences entre les médianes de groupe et le test de Kruskal-Wallis. Les densités de parasites déterminées par microscopie et calculées à partir des valeurs de Ct ont été comparées à l’aide de la corrélation de Pearson. La signification statistique a été définie comme une valeur de p -tarrêt de ≤ Nous avons effectué toutes les analyses dans la version R http: // www- projectorg ou GraphPad Prism version d Logiciel GraphPad

Approbation éthique

Le Comité d’Ethique de la Faculté de Médecine, de Pharmacie et de Dentisterie de l’Université des Sciences, Techniques et Technologies de Bamako, et le Comité de Revue Institutionnelle de l’Institut National des Allergies et Maladies Infectieuses, National Institutes of Health, ont approuvé cette étude. le consentement éclairé a été obtenu auprès des participants adultes et des parents ou des tuteurs des enfants participants L’étude est enregistrée dans la base de données ClinicalTrialsgov NCT

RÉSULTATS

De mai à mai, des individus en bonne santé ont été inclus dans cette étude. Au moment de l’inscription, juste avant la saison du paludisme, des individus étaient infectés par P. falciparum et infectés par P. malariae, comme déterminé par PCR; individus% avaient des infections mixtes avec P. falciparum et P. malariae Tableau Toutes les analyses subséquentes concernent les individus qui ont été trouvés non infectés lors de l’enrôlement.

Tableau de référence Caractéristiques de tous les participants à l’étude par le groupe d’âge Caractéristique groupe d’âge Tous les N = – yn = – yn = – yn = – yn = sexe féminin Plasmodium falciparum à frottis positif à l’inscription PCR positif Plasmodium malariae Frottis positif lors de l’inscription PCR positives infections mixtes par PCR PCR négative pour toutes les espèces de Plasmodium Caractéristique groupe d’âge Tous les N = – yn = – yn = – yn = – yn = sexe féminin Plasmodium falciparum frottis positif à des infections d’inscription PCR positif Plasmodium malariae frottis positif lors de l’inscription de PCR positifs mixtes par PCR PCR négatif pour tout Espèce Plasmodium Abréviation: PCR, amplification en chaîne par polyméraseVue Large comme prévu dans une zone de P falciparum intense le risque de paludisme clinique différait entre les groupes d’âge en tant que substitut de l’exposition cumulative à P. falciparum; La figure A; test de log-rank, P =, avec un délai médian plus long jusqu’au premier épisode de paludisme dans les groupes plus âgés Tableau En revanche, le risque d’infection au stade sanguin de P falciparum déterminé par PCR ne varie pas avec l’âge Figure B; test de log-rank, P = Cependant, les adultes âgés de – ans ont démontré un retard de l’infection comparé aux jeunes enfants quand la méthode moins sensible de la microscopie des frottis sanguins a été utilisée Figure C et Tableau, test de log-rank, P =; Table, log-rank test par paire entre les adultes et les enfants âgés – ans, P =, et les adultes et les enfants de – ans, P = de la note,% des individus sont restés sans parasitémie pendant au moins jours après l’inscription, ce qui suggère que le sang-stade ultérieur l’infection résulte d’une transmission renouvelée de P falciparum plutôt que d’une recrudescence d’infections au stade sanguin qui étaient sous-patentes à l’inscription. Le tableau fournit un résumé détaillé du paludisme clinique et du risque d’infection à P. falciparum par groupe d’âge.

Tableau Plasmodium falciparum Stade sanguin Infection et paludisme Paramètres des épisodes par groupe d’âge Paramètre Groupe d’âge Tous N = P Valeur – yn = – yn = – yn = – yn = Jours médians de l’enrôlement au premier épisode paludéen% CI – – -NA NE ND a Densité parasitaire médiane pour les premiers épisodes palustres dans les parasites / μL intervalle interquartile – – – – – b Individus avec ≥ paludisme% du groupe d’âge c Jours médians jusqu’à la première infection à P. falciparum% IC PCR – – – – ND a Microscopie – – – -NA ND a Densité parasite médiane calculée pour les premières infections parasitaires / μL interquartile à distance – – – – – b Individus avec ≥ P infections à P. falciparum% du groupe d’âge c Paramètre Groupe d’âge Tous N = P Valeur – yn = – yn = – yn = – yn = Jours médians entre l’inscription et le premier épisode de paludisme% IC – – -NA NE ND a Densité parasitaire médiane pour les premiers épisodes palustres dans les parasites / μL intervalle interquartile – – – – – b Individus avec ≥ paludisme% du groupe d’âge c Jours médians jusqu’à la première infection à P. falciparum% IC PCR – – – – ND a Microscopie – – – -NA ND a Densité médiane calculée pour les premières infections parasitaires / μL interquartile à distance – – – – – b Individus avec ≥ P infections à P. falciparum% du groupe d’âge c Abréviations: IC, intervalle de confiance; NA, non disponible; ND, pas fait; NE, non estimé car le pourcentage de personnes ayant bénéficié d’un suivi complet est resté indemne de paludisme pendant la période d’étude; PCR, réaction en chaîne de la polymérase test du log-rank du groupeb Test de la somme des rangs de Kruskal-Wallis test exact du Fisher Calculé à partir des valeurs seuils du cycle de PCR quantitatives pour les premières infections PCR-positives seulement; se référer à Méthodes pour les dérivations de la densité parasitaire calculéeView Large

Tableau Test de classement par paires de paires P Valeurs du délai jusqu’à la première infection entre groupes d’âge par méthode de détection parasitaire Groupe d’âge – y – y – y – y – y – y – y – y Groupe d’âge – y – y – y – y – y La matrice représente les valeurs P des tests de log-rank effectués entre les groupes d’âge notés par les étiquettes des lignes et des colonnes pour le délai de première infection par réaction en chaîne de la polymérase moitié gauche et le premier frottis positif supérieur droit Grand

Figure Vue détailléeTarifs de Kaplan-Meier, stratifiés par âge, pour le premier épisode clinique de paludisme et le délai jusqu’à la première infection par P falciparum par PCR B et par microscopie C Abréviation: PCR, réaction en chaîne de la polyméraseFigure Voir grandTélécharger Diagrammes de Kaplan-Meier, stratifiés par Abréviation: PCR, amplification en chaîne par polymérase Ces données indiquent que l’immunité stérile à l’infection à P. falciparum n’est pas acquise malgré des années d’exposition répétée; cependant, il reste possible qu’une immunité hépatique partielle soit acquise, ce qui pourrait limiter le nombre de parasites sortant du foie dans la circulation sanguine. Pour explorer cette possibilité, nous avons effectué des qPCR sur des taches de sang séché correspondant à la première infection détectée par PCR. la période d’étude Nous avons corrélé les densités de parasites calculées cPD dérivées des valeurs de qPCR Ct avec les densités de parasites réelles à partir de frottis sanguins obtenus simultanément à partir de la même figure individuelle supplémentaire; Pearson r =, P & lt; Nous avons également calculé les densités parasitaires à partir des valeurs qPCR relatives en utilisant la méthode -ΔΔCt et un standard parasite / μL comme échantillon de référence. Cependant, cette méthode a montré une corrélation plus faible avec les données de microscopie. Pearson r =, P & lt; Ainsi, nous avons utilisé la cPD dérivée du Ct absolu dans toutes les analyses ultérieures. Bien que la cPD médiane ait diminué avec l’âge, cette tendance n’était pas statistiquement significative. Kruskal-Wallis χ =, P = Les densités parasitaires pour les premiers épisodes palustres, déterminées par microscopie, étaient environ un ordre de grandeur supérieures à la cPD au cours des premières infections PCR-positives et diminuaient également avec l’âge. Kruskal-Wallis χ =, P =

DISCUSSION

De même, le vaccin antipaludique RTS, S, le plus avancé, qui cible une protéine de surface des sporozoïtes appelée protéine circumsporozoïte, induit une protection stérile contre l’infection chez environ% des adultes naïfs de paludisme provoqués par P falciparum. semaines après la dernière vaccination, bien que seulement% des sujets protégés soient restés protégés après des mois de réexposition Fait important, chez les nourrissons africains, RTS, S n’a montré qu’une efficacité d’environ% pour réduire les épisodes cliniques de paludisme et ne fournit pas de protection durable. infection Le mécanisme par lequel RTS, S, un vaccin qui cible les stades sporozoïtes et hépatiques, confère une protection partielle contre la maladie au stade sanguin reste largement inexpliqué Il est possible que RTS, S induit une protection contre le paludisme clinique en réduisant temporairement le nombre de mérozoïtes émergeant du foie Ceci peut conduire à une exposition prolongée à des niveaux subcliniques de parasitaires au stade sanguin, ce qui permet de stimuler l’immunité acquise naturellement au stade sanguin Compte tenu de l’intérêt croissant pour le développement de vaccins visant à induire une protection stérile en ciblant le stade sporozoïte et hépatique, des études sont nécessaires pour comprendre pourquoi L’immunité stérile n’est pas induite par une infection naturelle dans les zones endémiques et la mesure dans laquelle cette réfraction apparente pourrait interférer avec la vaccination. Les explications possibles du manque d’immunité stérile naturellement acquise dans cette population incluent la diversité génétique étendue des antigènes préérythrocytaires dans les zones endémiques. inoculum de sporozoïtes provenant de moustiques infectés , ou dysrégulation d’effecteurs immunitaires potentiels tels que les anticorps ou les lymphocytes T CD La restriction de classe I du CMH des épitopes des lymphocytes T préérythrocytaires les plus efficaces peut sévèrement limiter la fréquence des répondeurs dans les populations présentant divers haplotypes HLA [ ] En outre, la malnutrition et les coïncidences chroniques peuvent contra En effet, les études qui identifient les mécanismes sous-jacents à l’acquisition naturelle de l’immunité stérile peuvent s’avérer plus importantes pour le développement de vaccins préérythrocytaires que les études qui ont tenté de lier diverses réponses immunitaires à On présume que des biomarqueurs reflétant la charge parasitaire du stade hépatique peuvent permettre de démêler les contributions relatives de l’immunité hépatique au stade précoce de l’immunité hématopoïétique dans le contrôle de la parasitémie initiale. les paramètres peuvent ne pas être informatifs pour le développement d’un vaccin pré-érythrocytaire Dans cette étude, les patients% ayant un suivi complet ne sont pas infectés pendant toute la saison de transmission, et les% d’entre eux ont un retard de> ≥ jours; Une explication possible est que les individus non infectés étaient moins exposés aux piqûres de moustiques infectieuses, peut-être à cause de l’utilisation de moustiquaires imprégnées d’insecticide ou d’autres facteurs comportementaux. Bien que la surveillance parasitologique bihebdomadaire ait réduit la Ceci soulève un point important concernant la sensibilité du test. Bien que plus sensible que la détection microscopique, la limite de détection pour les tests PCR utilisés dans cette étude était d’environ parasite / μL de sang, comparable aux méthodes utilisant de l’ADN extrait de petits coups de sang séché sur papier filtre mais moins sensible que les tests de détection par PCR qui atteignent des sensibilités de parasites / μL en utilisant du matériel génétique obtenu à partir de μL de sang Avons-nous interrogé de plus grandes quantités de bl Nous avons peut-être détecté des infections plus tôt et plus souvent et peut-être constaté une plus grande différence entre le temps médian de la PCR et le taux de frottis sanguin Tableau Il est également concevable qu’il y ait des déterminants génétiques de l’hôte Plusieurs déterminants génétiques de l’hôte ont été associés à la protection contre le paludisme clinique Cependant, à notre connaissance, le trait drépanocytaire, qui est présent dans environ% des données non publiées de nos participants, est le seul facteur génétique associé au retard. En résumé, malgré des années d’exposition à une transmission intense du paludisme, il n’y a aucune preuve de l’acquisition d’une immunité stérile contre l’infection par P. falciparum chez des patients infectés par P. falciparum. Personnes vivant dans des zones endémiques Comprendre pourquoi les infections à P. falciparum répétées n’induisent pas de protection stérile pour élaborer des vaccins ciblant le stade hépatique chez les personnes vivant dans des zones d’endémie palustre

Remarques

RemerciementsNous remercions les participants à l’étude et le personnel de soutien à la recherche à Kalifabougou et Bamako au Mali ainsi que Susan Pierce et Louis Miller pour leurs discussions utiles. Les contributions MT, SL, SD, KK, AO, OKD, BT et PDC ont conçu et conçu étude et expériences TMT, SL, CH et PDC ont analysé les données KK, AO, DD, SN, JA, AB, YK, MN, CD, et AT géré la collecte de données cliniques et des échantillons biologiques SL, BA, YK, DD, JA, et AT effectué les essais TMT et PDC a écrit le manuscritSupport financierCe travail a été soutenu par la Division de la recherche intramurale, Institut national des allergies et des maladies infectieuses, National Institutes of HealthPotential conflits d’intérêts Tous les auteurs: Aucun conflit signaléTous les auteurs ont soumis le formulaire ICMJE pour la divulgation des conflits d’intérêts potentiels Les conflits que les éditeurs jugent pertinents pour le contenu du manuscrit ont été divulgués