Signification pronostique des niveaux d’ADN du virus JC dans le liquide céphalorachidien de patients atteints de leucoencéphalopathie multifocale progressive associée au VIH

Contexte Leucoencéphalopathie multifocale progressive La LMP demeure une complication fréquente et potentiellement mortelle de l’infection par le virus de l’immunodéficience humaine à l’ère du traitement antirétroviral hautement actif. Bien que la moitié des patients atteints de cette maladie survivent, l’issue est imprévisible au diagnostic et les marqueurs pronostiques Les taux d’ADN de JCV ont été mesurés dans des échantillons de liquide céphalo-rachidien prélevés sur des patients infectés par le VIH et atteints de LEMP, y compris des patients traités par HAART et des patients n’ayant pas reçu de multithérapie. Le résultat pronostique a été évalué en comparant les taux d’ADN de JCV avec la survie et d’autres variables du patient. Résultats Le test avait une sensibilité diagnostique de % et spécificité de% Dans le premier C Échantillon de SF obtenu après l’apparition des symptômes de la LEMP, les valeurs d’ADN de JCV allaient d’indétectables à des copies de journal / mL médian, des copies de journal / ml des niveaux d’ADN de JCV & gt; Cependant, aucune relation n’a été trouvée chez les patients traités par HAART. L’analyse des échantillons séquentiels de LCR obtenus chez des patients a montré une diminution marquée des taux d’ADN de JCV par rapport à ceux des patients non traités par HAART. Conclusion: La mesure des taux d’ADN de JCV dans les échantillons de liquide céphalo-rachidien pourrait être un marqueur virologique utile pour la prise en charge de la LEMP chez les patients recevant un traitement antirétroviral.

L’introduction du HAART pour le traitement de l’infection par le VIH a été suivie d’une diminution de l’incidence de la leucoencéphalopathie multifocale progressive liée au VIH , et d’une survie prolongée des patients atteints de cette maladie . La LMP a été moins marquée que la diminution des autres maladies opportunistes liées au VIH du SNC, entraînant une prévalence accrue de la LMP par rapport à ces autres maladies En outre, la maladie se stabilise ou s’améliore cliniquement chez environ la moitié des patients HAART, alors que le résultat est encore progressivement mortel chez les patients qui ne reçoivent pas HAART En outre, les patients qui survivent sont généralement laissés avec séquelles neurologiques sévères Le résultat de la LEMP chez les patients recevant HAART est imprévisible à l’apparition de la maladie; Le marqueur virologique le plus prometteur de la LEMP est le virus JC La détection d’ADN JCV dans le LCR par des techniques d’amplification des acides nucléiques L’amplification de l’ADN JCV dans le LCR est un outil bien établi pour le diagnostic non invasif de la LEMP. peut être éliminé du LCR des patients traités par HAART chez qui la LEMP se stabilise , et il a été proposé comme un indicateur de l’activité de la maladie chez les patients recevant HAART, en association avec des critères cliniques et radiologiques dosage PCR quantitatif pour évaluer la signification diagnostique et pronostique des taux d’ADN de JCV dans le LCR

Patients et méthodes

les patients qui n’ont pas été traités par HAART et qui ont été observés entre et recevant de la cytarabine intrathécale et intraveineuse; Pour évaluer la sensibilité diagnostique du test de PCR en temps réel, la charge d’ADN de JCV a été mesurée dans des échantillons de liquide céphalo-rachidien provenant de patients présentant un diagnostic histologique de PML déterminé. Chez les patients ayant un diagnostic post-mortem, des échantillons de liquide céphalo-rachidien ont été prélevés pendant une période médiane de plusieurs jours avant le décès. Pour évaluer la spécificité diagnostique, des échantillons de liquide céphalorachidien provenant de patients supplémentaires atteints d’autres maladies du SNC Les échantillons de patients atteints d’encéphalite à VIH, d’encéphalite à cytomégalovirus, de tuberculose, de toxoplasmose, de cryptococcose, de lymphome ou de lésions non spécifiques ont été examinés dans ces cas. Les échantillons de liquide céphalorachidien ont été De chaque patient, le premier échantillon de LCR obtenu après Les échantillons ont été prélevés sur des patients atteints de LEMP, y compris des patients traités par HAART et qui ne l’étaient pas. Dans tous les cas, des échantillons de liquide céphalorachidien ont été obtenus à des fins de diagnostic ou de gestion après avoir été informés. consentement du patient. PCR en temps réel et autres mesures. Les acides nucléiques ont été extraits de -μL échantillons de LCR en utilisant le QIAamp Blood Kit Qiagen et ont été élués dans un volume final de μL d’amplification d’ADN JCV et la détection a été réalisée avec le système ABI Prism. Biosystèmes Appliqués Une courbe standard a été préparée, consistant en des dilutions successives de la gamme d’ADN plasmidique, des copies / ml obtenues en clonant le génome complet de JCV dans le plasmide pBR au site EcoRI fourni gracieusement par le Dr Thomas Weber [Hambourg, Allemagne] standard, chaque échantillon, et le contrôle négatif ont été analysés en triple dans chaque série Un contrôle interne, composé de copies / mL de plasmidi ADN a été ajouté aux aliquotes pour chaque échantillon. Les amorces et les sondes ont été choisies dans la grande région de l’antigène T et constituées de TGG GAT TGG GAT CCT GTG TTT TC- « avant » GAG AAG TGG GAT GAA GAC CTG TTT – ‘reverse et’ -FAM-TCA TCA CTG GCA AAC ATT TCT TCA TGG C-TAMRA- ‘sonde A -μL échantillon et -μL mélange PCR μL Universal Mastermix, contenant nmol / L d’amorce directe, nmol / L d’amorce inverse Les paramètres du cycle étaient: ° C pour min, ° C pour min, cycles à ° C pour sec, et ° C pour min A Une valeur de cycle de seuil Ct a été calculée pour chaque tube étalon ou échantillon en déterminant le point auquel la fluorescence a dépassé la limite de seuil La courbe de référence a été obtenue en calculant la moyenne des valeurs Ct obtenues pour chaque étalon et en traçant ces valeurs par rapport aux concentrations d’ADN JCV connues. La moyenne des valeurs Ct obtenues dans les aliquotes sans le contrôle interne ont été calculées et tracées La charge d’ADN de JCV était exprimée en log du nombre de copies par millilitre d’échantillon. Pour évaluer la sensibilité analytique et la spécificité de l’essai, dilutions du plasmide JCV ou des plasmides pBR et H contenant le virus BK entier. On a défini la reproductibilité intra-essai et inter-essai en calculant les coefficients de variation écart-type: valeur moyenne des valeurs de Ct obtenues en testant des réplications intra-essai ou inter-essai des dilutions standard de la courbe. temps de mesures d’ADN JCI du LCR en utilisant le test standard ou ultrasensible Roche Amplicor Cobas avec des limites de détection de copies / mL et de copies / mL respectivement. La corrélation de Spearman et le test were ont été utilisés pour tester les associations entre les variables continues et catégorielles. variables, médianes et valeurs du percentile th-quartile quartile [Q] à quartile Le modèle de régression des hasards proportionnels de Cox a été utilisé pour évaluer l’association entre la survie et les variables continues en analyse univariée. Rapports de risque Les HR et les IC sont rapportés La distribution des temps de survie a été estimée par la méthode de Kaplan-Meier avec comparaisons Parmi les sujets présentant des déterminations de charge d’ADN JCV répétées, les pentes de l’ADN JCV, des numérations cellulaires CD sanguines et des valeurs plasmatiques de l’ARN du VIH au cours du temps β ont été étudiées et comparées entre les groupes de patients. Test de Whitney U La stabilisation ou la progression de la maladie a été définie en présence de critères cliniques et radiologiques de maladie inactive ou active, respectivement. À des fins statistiques, les valeurs négatives d’ADN JCV ont été définies. ont été définis comme égal à copies / mL

Résultats

Sensibilité analytique, spécificité et reproductibilité La sensibilité analytique du test était comprise entre et copies / mL Avec l’utilisation de ce test, l’autre polyomavirus humain, le virus BK, était détectable à des concentrations ⩾ copies / ml, alors que VS était détectable à des concentrations ⩾ copies / mL Le coefficient de variation intra-essai était pour les standards de, et copies / mL ou pour copies / mL Le coefficient de variation inter-essai était pour un standard de copies / mL, pour et copies / mL, ou pour des copies / fiabilité mLDiagnostic JCV DNA a été détecté dans des échantillons de liquide céphalo-rachidien obtenus à partir de patients ayant une valeur médiane de PML confirmée histologiquement, des copies log / mL; intervalle, & lt; – log copies / mL, résultant en% de sensibilité diagnostique% IC,% -% Chez aucun des patients témoins, l’ADN JCV n’a été détecté dans les échantillons de LCR, donnant une spécificité% IC%,% -% Correlations entre JCV Charge d’ADN et variables des patients Les caractéristiques des patients au moment du premier prélèvement du LCR sont indiquées dans le tableau A ce moment, l’ADN JCV a été détecté en% des patients atteints de LEMP, avec des valeurs allant de indétectables à log / mL médiane Aucune distribution différente des valeurs d’ADN de JCV n’a été observée entre les patients ayant reçu HAART et ceux qui n’en avaient pas au moment de l’échantillonnage. Aucun des groupes n’a trouvé de corrélation entre les taux d’ADN JCV et le nombre de jours entre l’apparition des symptômes. et échantillonnage CSF

Tableau View largeDownload slide Caractéristiques démographiques et cliniques des patients au moment du premier prélèvement de LCR après l’apparition de la leucoencéphalopathie multifocale progressive PMLTable View largeTélécharger les caractéristiques démographiques et cliniques des patients au moment du premier prélèvement de LCR après l’apparition d’une leucoencéphalopathie multifocale progressive PMLIn univariée analyse, les niveaux d’ADN JCV du LCR ont été corrélés à la survie, comme d’autres variables, y compris l’utilisation de HAART après l’échantillonnage du LCR, les numérations cellulaires CD et les taux d’ARN du VIH du plasma ou du LCR. de l’échantillonnage du liquide céphalorachidien HR; % CI, -; P & lt; et à partir de l’apparition des symptômes HR, % CI, -; P & lt; Le niveau d’ADN de JCV n’était pas un prédicteur significatif de survie lorsqu’il était évalué comme variable continue ou dichotomique et en utilisant une valeur seuil de copies log / mL, c.-à-d. La valeur médiane du niveau d’ADN JCV dans les premiers échantillons de LCR UNE

Figure Vue grandDownload slideKaplan-Meyer courbes de survie selon JC virus JCV ADN niveaux dans le premier échantillon CSF La survie est calculée à partir du moment où l’échantillon CSF a été obtenu Filled line, un niveau d’ADN JCV de & gt; copies de journal / mL; ligne pointillée, un niveau d’ADN de JCV de ⩽ log copies / ml A, tous les patients P valeur n’était pas significative selon le test de log-rank; B, Patients non traités par HAART P =; C, les patients traités avec la valeur HAART P n’étaient pas significatifs selon le test du log-rank; D, Seuls les patients décédés d’une leucoencéphalopathie multifocale progressive, y compris les patients traités par HAART et les patients non traités par P = Figure Voir grandDownload slideKaplan-Meyer courbes de survie selon JC virus JCV ADN niveaux dans le premier échantillon CSF La survie est calculée à partir du moment à laquelle l’échantillon CSF a été obtenu Filled line, un niveau d’ADN JCV de & gt; copies de journal / mL; ligne pointillée, un niveau d’ADN de JCV de ⩽ log copies / ml A, tous les patients P valeur n’était pas significative selon le test de log-rank; B, Patients non traités par HAART P =; C, les patients traités avec la valeur HAART P n’étaient pas significatifs selon le test du log-rank; D, Seuls les patients décédés de leucoencéphalopathie multifocale progressive, y compris les patients traités par HAART et les patients non P = La valeur pronostique possible de la charge d’ADN JCV dans le LCR pour la survie a été analysée séparément chez les patients recevant HAART et ceux qui ne l’ont pas. Chez les patients qui n’ont pas été traités par HAART, une charge de JCV dans CSF de & gt; Les copies log / mL étaient associées à une durée de survie significativement plus courte à la fois depuis le prélèvement du LCR et le début de la LEMP Cette corrélation n’était pas maintenue chez les patients traités par HAART Cependant, cette corrélation était présente si seuls les patients décédés de LEMP étaient considérés. , indépendamment de l’apport HAART figure B-D Parmi les patients décédés de LEMP, des taux d’ADN JCV plus élevés dans le LCR ont été observés chez des patients dont les échantillons de LCR ont été prélevés à un intervalle plus court avant la mort ρ, -; P = Niveaux d’ADN de JCV & gt; Des copies de log / mL ont été observées chez% des patients ayant un nombre de cellules CD de ⩽ cellules / μL, mais seulement chez% des patients ayant un nombre de cellules CD de & gt; cellules / μL P = La corrélation entre les taux élevés d’ADN JCV et les faibles numérations cellulaires CD est devenue significative chez les patients qui n’ont pas été traités par HAART [%] vs [%] de; P =, mais pas chez ceux recevant HAART au moment de l’échantillonnage du LCR [%] vs [%] Aucune association significative n’a été observée entre le taux d’ADN JCV dans le LCR et la charge d’ARN du VIH dans le plasma ou le LCR. Répartition des patients en groupes selon qu’ils recevaient une multithérapie au moment de l’échantillonnageAnalyse des mesures répétées du LCR La pente de la variation des taux d’ADN JCV dans le LCR au cours du temps, c.-à-d. étaient significativement plus faibles chez les patients ayant reçu HAART, par rapport aux patients qui ne l’ont pas été. Chez les patients traités par HAART, les taux d’ADN JCV ont diminué de façon marquée chez les patients stabilisés mais pas chez ceux ayant une maladie persistante.

Figure Vue largeTélécharger des lignes de tendance des niveaux d’ADN JCV du virus JC à partir de la date à laquelle le premier échantillon de LCR a été obtenu. A, Patients n’ayant pas reçu HAART n =; valeur β médiane,; Q-Q, – à Cinq patients ont reçu la cytarabine B, les patients traités par HAART montrant la progression de la maladie n =; valeur médiane β, -; Q-Q, – à – C, patients traités par HAART présentant une stabilisation de la maladie n =; valeur médiane β, -; Q-Q, – to – Les valeurs β étaient significativement plus faibles pour les patients présentés dans les panels B et C considérés dans leur ensemble, comparés à ceux des patients présentés dans le panel A P =; Les valeurs β étaient également significativement plus faibles pour les patients du panel C comparés à ceux des patients du groupe BP = Figure View largeTélécharger les lignesTrend les lignes des niveaux d’ADN JCV du virus JC à partir de la date d’obtention du premier échantillon CSF A, Patients non traités recevoir HAART n =; valeur β médiane,; Q-Q, – à Cinq patients ont reçu la cytarabine B, les patients traités par HAART montrant la progression de la maladie n =; valeur médiane β, -; Q-Q, – à – C, patients traités par HAART présentant une stabilisation de la maladie n =; valeur médiane β, -; Q-Q, – to – Les valeurs β étaient significativement plus faibles pour les patients présentés dans les panels B et C considérés dans leur ensemble, comparés à ceux des patients présentés dans le panel A P =; Les valeurs β étaient également significativement plus faibles pour les patients du panel C que pour les patients du groupe BP. Le tableau montre les valeurs d’ADN JCV dans le LCR pour les temps d’obtention du premier et du dernier CSF, ainsi que le nombre de cellules CD et le plasma. Valeurs de l’ARN du VIH aux mêmes moments Les valeurs de β de l’ARN du VIH et de l’ADN du VIH étaient strictement corrélées chez les patients traités par HAART chez qui la PML stabilisait P =, mais pas chez les patients ayant présenté une progression de la maladie. Taux d’ARN du VIH au cours du temps une valeur β médiane de – [Q-Q, – à -], comparée à une valeur β médiane de – [Q-Q, – to]; P =, et une tendance vers une augmentation plus prononcée du nombre de cellules CD une valeur β médiane de [Q-Q, -], comparée à une valeur β médiane de [Q-Q, -]; P = les cellules CD et les tendances plasmatiques de l’ARN du VIH n’ont pas été analysées chez les patients qui n’étaient pas traités par HAART en raison du petit nombre de mesures supplémentaires disponibles

Tableau View largeTélécharger slideJC virus JCV Niveau d’ADN dans le LCR, numération des cellules CD dans le sang et taux d’ARN du VIH dans le plasma au moment des premiers et derniers échantillons du LCR obtenus chez des patients atteints de leucoencéphalopathie multifocale progressive. Taux d’ADN dans le LCR, numération des cellules CD dans le sang et taux d’ARN du VIH dans le plasma au moment du premier et du dernier LCR obtenus chez des patients atteints de leucoencéphalopathie multifocale progressive LEMP après l’apparition de la maladie Aucune différence significative n’a été observée dans la variation des taux d’ADN JCV entre les patients recevant HAART et la valeur β médiane du cidofovir, -; Q-Q, – et patients recevant la valeur β médiane seule de la multithérapie HAART, -; Chez les patients recevant HAART et le cidofovir, les taux médians d’ADN de JCV ont diminué par rapport aux copies log / mL Q-Q, – dans le premier échantillon à des copies de journal / mL Q-Q, – dans le dernier échantillon; les valeurs médianes ont diminué de copies de journal / mL Q-Q, – à log copies / mL Q-Q, – chez les patients traités avec HAART seul

Discussion

En revanche, l’association entre les taux d’ADN JCV au diagnostic et la survie n’était pas présente chez les patients traités par HAART. Cet effet semble être déterminé exclusivement par la proportion de patients chez qui la PML a diminué, car des niveaux élevés d’ADN JCV restent associés. avec une courte survie chez les patients traités par HAART avec une maladie mortelleNos résultats pour les patients qui n’ont pas été traités avec HAART sont similaires à ceux obtenus pour les patients inscrits dans l’essai de cytarabine, qui a commencé avant que HAART soit disponible ; Ces résultats montrent une association entre les taux d’ADN JCV des ⩾ génomes / mL, estimés par une procédure semi-quantitative, et une survie courte Nous avons également trouvé des niveaux d’ADN JCV plus élevés chez les patients dont les échantillons de CSF étaient plus proches de la mort. l’observation qu’il était courant dans l’ère pré-HAART pour les échantillons de LCR initialement négatifs pour l’ADN JCV d’avoir des résultats positifs sur des examens supplémentaires Globalement, ces observations suggèrent qu’en l’absence de HAART, les taux de réplication de JCV dans les échantillons de liquide céphalorachidien peut refléter une progression plus rapide de la LEMP, bien que les taux d’ADN viral puissent augmenter davantage au cours de la maladie. En outre, une association significative entre des concentrations élevées de JCV et de faibles numérations de CD, c.-à-d. Des cellules / μL ont également été observées chez des patients non traités par HAART. A ce propos, plusieurs patients avec des LME caractérisés par une progression lente en l’absence de traitement antirétroviral ont été précédemment documentés, et des taux élevés de CD ont été observés presque invariablement dans ces cas. Enfin, aucune corrélation n’a été observée entre le taux d’ADN de JCV dans les échantillons de LCR et les taux d’ARN du VIH dans les échantillons de plasma ou de LCR chez les patients, qu’ils aient ou non reçu HAART, qui plaide contre un effet direct du VIH sur la réplication JCV Bien que la détermination en un seul point des taux d’ADN JCV au moment du diagnostic ne semble pas être utile pronostiquement chez les patients traités par HAART, l’analyse des échantillons séquentiels a montré que patients traités chez qui la LEMP s’est stabilisée, contrairement aux patients qui n’ont pas reçu de HAART ou de La réduction ou la suppression de la réplication JCV dans le SNC pourrait donc être la condition préalable pour que la LEMP devienne inactive et représente un marqueur pronostique des résultats favorables. Cet effet semble également expliquer l’association précédemment signalée entre des taux d’ADN JCV faibles ou indétectables dans Des échantillons de LCR et une longue survie chez les patients sous HAART [,,] Un nombre pertinent d’échantillons analysés dans ces études antérieures ont été obtenus plusieurs mois après l’apparition de la LEMP chez des patients présentant une stabilisation de la maladie. résultat Ensemble, nos observations peuvent contribuer à caractériser l’impact du HAART sur l’histoire naturelle de la LEMP En l’absence de traitement, les défenses de l’hôte pourraient exercer un contrôle relatif sur la réplication du JCV dans le SNC, déterminant ainsi le rythme de progression de la maladie. l’étendue initiale de la réplication JCV et le degré de déficience du système immunitaire semble être non lo Cependant, un tel modèle ne s’appliquerait pas à la proportion de patients traités par HAART chez qui la LEMP s’aggrave malgré des réponses optimales en termes de diminution des charges de VIH et d’augmentation du nombre de cellules CD. Il est possible que ces patients ne restaurent pas l’immunité à médiation cellulaire et / ou humorale spécifique à JCV D’autre part, des réactions tissulaires inflammatoires ont été associées à une aggravation de la PML lors de l’administration de HAART . De fortes réponses d’ARN VIH et de cellules CD chez des patients ayant une élévation persistante des taux d’ADN JCV et de progression de la LEMP Bien que cette observation doive être confirmée chez de grands groupes de patients, elle soutient l’hypothèse selon laquelle une réponse forte au traitement antirétroviral pourrait être préjudiciable et même conduire à la progression paradoxale de la LEMP En résumé, les niveaux élevés d’ADN de JCV dans les échantillons de LCR obtenus au début de la LEMP se sont avérés être des facteurs prédictifs. Un faible taux de survie chez les patients atteints de LEMP était associé à un faible nombre de cellules CD chez les patients non traités par HAART et chez les patients traités par HAART. Cependant, une réduction ou une suppression de la charge d’ADN JCV dans le LCR des patients La mesure de la charge d’ADN de JCV dans des échantillons de LCR avec l’utilisation de la PCR en temps réel semble être un marqueur virologique fiable de l’activité de la maladie chez les patients recevant un traitement antirétroviral HAART. , et il semble être d’intérêt potentiel pour les essais cliniques portant sur de nouvelles approches thérapeutiques

Remerciements

Soutien financier Istituto Superiore di Sanità, Rome, Italie, Programme national de lutte contre le SIDA, Projet DPotentiel de conflits d’intérêts Tous les auteurs: pas de conflits