Perspective sur les modèles animaux: Infections intracellulaires chroniques

La maladie humaine systémique causée par les organismes du complexe Mycobacterium avium-Mycobacterium intracellulare MAC représente une infection intracellulaire chronique chez des hôtes humains qui sont habituellement immunodéprimés Pour développer un traitement et une prophylaxie améliorés, et pour obtenir une meilleure compréhension de la pathogenèse, nous avons étudié / beige provoqué par voie orale ou intraveineuse avec un isolat humain qui provoque une maladie létale chez les patients atteints de SIDA MAC, sérovar Encourager les études anti-MAC chez les animaux, comme examiné ici, devrait fournir la base pour envisager des essais humains avec un agent prometteur agent pour atteindre des concentrations intracellulaires élevées a été corrélée avec l’activité in vivo de plusieurs composés spécifiques

Les organismes appartenant au complexe Mycobacterium avium-Mycobacterium intracellulare MAC sont d’origine environnementale, mais chez certains mammifères immunodéprimés, les organismes MAC persistent et se multiplient dans les phagocytes mononucléaires du système réticulo-endothélial, bien que d’autres mycobactéries telles que Mycobacterium tuberculosis et des organismes pyogènes Listeria monocytogenes a reçu plus d’attention en tant que pathogènes intracellulaires, l’avènement de la pandémie de SIDA en Amérique du Nord et en Europe occidentale a présenté aux cliniciens une occasion sans précédent d’étudier une infection sanguine persistante due à la MAC. il est apparu que les patients avec un SIDA clinique avancé tel que défini par le nombre de lymphocytes CD de ≤ cellules / mm étaient très susceptibles de développer une bactériémie MAC et de mourir sans prophylaxie antimicrobienne active , un effort urgent a été entrepris pour étudier l’épidémiologie clinique le di sease chez les patients atteints du SIDA et de développer des thérapies améliorées et la prophylaxie Le développement de nouvelles thérapies requis de travailler avec un modèle animal ou un système de test avant l’initiation de toutes les études humaines

Perspective historique

Il y a près de plusieurs décennies, nous avons entrepris d’évaluer des agents expérimentaux pour la chimiothérapie de la MAC systémique. Bien que tous les premiers patients atteints du SIDA ne fassent pas d’hémocultures ou de cultures autopsiques pour les mycobactéries, il était évident que MAC était le D’ici là, les défauts immunitaires classiques caractérisant le SIDA – à savoir, un faible nombre de lymphocytes CD, comme cela se produit chez les patients atteints de certains lymphomes – ont été bien caractérisés La nécessité d’un animal approprié Le modèle était évident Nous souhaitions identifier des agents potentiellement prometteurs à travers des criblages in vitro, mais avant toute intervention humaine, une plus grande confiance dans les approches antimicrobiennes dériverait d’études convaincantes chez les animaux que ces agents promettaient. Au départ, nous avons trouvé difficile d’infecter des mammifères sains. et de produire la mortalité Il était clairement souhaitable de trouver un petit système de test de rongeurs In, Gangadharam et al décrit le souris beige C homozygote noir pour le trait beige comme un modèle animal approprié de MAC maladie Néanmoins, en utilisant cet animal relativement cher, disponible dans le commerce, même les chercheurs originaux ont échoué à produire la mortalité Nous avons examiné notre collection de souches isolées de patients atteints du sida qui ont bactériémie Par « virulents », nous entendons la capacité de produire une mortalité, de croître et d’induire des changements histopathologiques chez l’animal, bien qu’avec un inoculum relativement gros. Un certain nombre de souches testées pourraient provoquer bactériémie dans des niveaux constants d’infection tissulaire, mais pendant une période de quelques semaines à plusieurs mois, aucune augmentation incrémentielle de la charge de l’organisme n’a pu être détectée. En outre, les animaux ne sont pas morts dans un délai prévisible. sérotypes les plus communs isolés chez les patients atteints du SIDA. Il s’est avéré produire un taux de mortalité de après l’inoculation intraveineuse La charge de l’organisme reproductible pourrait être surveillée dans le poumon, le foie et la rate, et des échantillons sanguins quantitatifs pourraient être obtenus pour la culture d’une manière analogue à l’utilisation de systèmes commerciaux dits «isolateurs» qui ont quantifié la bactériémie MAC chez les patients humains atteints du sida

Figure Vue largeDownload slide Macrophages dérivés de monocytes humains cultivés infectés par la souche Mycobacterium avium pour des pointes de flèche de M avium peuvent être vus dans des vacuoles View largerTélécharger des macrophages dérivés de monocytes humains cultivés infectés avec la souche Mycobacterium avium pour des pointes de flèche M avium peuvent être vus dans vacuolesTable résume le rongeur Les études ont montré que les souris CD déplétées, les souris traitées à la cyclosporine, ou même les souris infectées par des rétrovirus murins les soi-disant MAIDS Cependant, après avoir travaillé avec des rongeurs MAIDS, nous avons constaté que les animaux mouraient rapidement d’un processus lymphomateux avant qu’il devienne possible d’évaluer quantitativement l’effet de l’infection MAC compliquée ou de son traitement.

Table View largeTélécharger certaines espèces murines / rongeurs qui ont été utilisées pour étudier le complexe Mycobacterium avium-Mycobacterium intracellulare MAC infectionsTable Voir en grandDisqueTélécharger Certaines espèces murines / rongeurs qui ont été utilisées pour étudier les infections à Mycobacterium avium-Mycobacterium intracellulare MAC Agents antimicrobiens éprouvés être actif dans le système de test de la souris beige sont résumés dans le tableau Il faut reconnaître que tous ces agents n’ont pas de données convaincantes in vivo ou cliniques sur l’efficacité clinique

Tableau View largeTélécharger certains agents thérapeutiques actifs contre le complexe Mycobacterium avium-Mycobacterium intracellulare MAC in vivo, en chronologie approximativeTable View largeTélécharger certains agents thérapeutiques actifs contre le complexe Mycobacterium avium-Mycobacterium intracellulare MAC in vivo, en ordre chronologique

Procédures standard pour évaluer l’activité anti-Mac

Avant d’entreprendre des études animales relativement expérimentales, notre approche conventionnelle consiste à dépister l’activité in vitro en utilisant le système commercial BACTEC. Il s’agit d’un système en phase liquide qui utilise un milieu de bouillon mycobactérien conventionnel modifié par l’utilisation de la méthode d’Inderlied et al. Cependant, notre expérience a montré que pour les infections intracellulaires fortement liées aux tissus, nous ne devrions pas jeter les composés de l’écran sans évaluation in vitro de cultures de macrophages in vitro et / ou de provocation de rongeurs vivants Le système de test de macrophages in vitro s’est avéré utile en tant que stade intermédiaire de dépistage avant que le défi animal plus coûteux des rongeurs ne soit entrepris. Bien qu’il ait été largement utilisé pour étudier la maladie intracellulaire chronique de nombreux chercheurs qui utilisent le culte des tissus Des approches originales, telles que la culture de macrophages in vitro, ont appris que lorsque des cellules phagocytaires adhérentes se détachent du milieu de culture en verre ou en plastique, une fausse impression d’effet résulte du lysat des cellules phagocytaires adhérentes restantes pour produire un comptage quantitatif des colonies.

Valeur prédictive du système de test sur les animaux dans la thérapie Mac et la prophylaxie

En ce qui concerne le système de souris beige, il a correctement anticipé l’activité in vivo de pratiquement tous les composés actifs chez l’homme. Par « activité chez l’homme », nous entendons soit l’activité prophylactique, soit l’activité thérapeutique. nouveaux composés macrolides, azithromycine et clarithromycine, parmi les agents de choix pour le traitement de la maladie MAC En outre, l’activité prophylactique a également été démontrée en utilisant ce système de test L’expérience clinique humaine avec la roxithromycine a été moins étendue. mais, comme cela est également actif dans le système de test de la souris beige et il existe des rapports anecdotiques dispersés d’utilisation chez les humains, on pourrait supposer que ce relativement nouveau au moins depuis l’érythromycine devenu agent pourrait être classé avec les autres agents Ethambutol a été préconisé par notre groupe et d’autres comme l’agent thérapeutique compagnon de Macrolides Ethambutol a également été montré pour avoir un effet plutôt reproductible, mais principalement bactériostatique, dans le système de test de la souris beige Aminoglycosides, tels que l’amikacine, ont également été montré pour être efficace dans le traitement des infections tissulaires Les données cliniques humaines sont moins convaincantes, car les données monothérapeutiques aminoglycosides n’ont pas été publiés Cependant, on pourrait en déduire que l’activité d’agents tels que les aminosides a été confirmée dans des études chez l’homme, comme California Collaborative Treatment Group-, où les agents compagnons étaient généralement inefficaces Les enseignements tirés du macrolide Les études chez l’animal sont que les composés avec des CMI de μg / mL ou μg / mL ne devraient pas être négligés dans les études in vivo. Ce sont des CMI typiques pour l’azithromycine, et nous reconnaissons clairement que les concentrations sériques de ce composé dépassent rarement μg / mL. , les données supportant une concentration tissulaire beaucoup plus élevée d’azithromycine ont également été publiées. des centrations ont été rapportées pour des agents apparentés aux macrolides, tels que la télithromycine

Leçons tirées des récentes études sur la méfloquine

Nos récentes expériences in vivo avec la méfloquine ont fourni un ensemble intrigant d’observations expérimentales qui soulignent la valeur du test du modèle animal avant qu’un composé soit poursuivi dans un cadre clinique ou rejeté de la considération clinique Mefloquine a été synthétisé & gt; Il y a des décennies, avec le soutien de la recherche militaire sur les maladies infectieuses Il est largement utilisé dans le monde entier pour la prophylaxie du paludisme à P. falciparum. Dans le processus de dépistage, nous avons constaté que la plupart de nos isolats de M par concentration de μg / mL ou de μg / mL de méfloquine Ce qui intriguait notre groupe était l’observation rapportée indiquant que la méfloquine est presque concentrée dans les cellules des mammifères Nous avons entrepris une série d’expériences dans lesquelles la méfloquine disponible dans le commerce, factorisée médicament actif, a été utilisé à une dose de mg / kg par jour et comparé aux doses d’azithromycine-clarithromycine et d’éthambutol qui étaient actives in vivo dans le système de test de souris beige Mefloquine s’est avérée active dans le système de test de souris beige. il a également ajouté à l’activité du macrolide. Dans quelques études supplémentaires que nous avons menées, un régime de combinaison impressionnant a inclus la méfloquine, m oxifloxacine et éthambutol Nous avons caractérisé une réduction nette de l’inoculum de départ aussi prononcée que celle observée avec n’importe quelle combinaison médicamenteuse contre MAC et certainement supérieure à celle observée avec soit l’azithromycine associée à l’éthambutol soit la clarithromycine associée à l’éthambutol. La bactériémie de ces animaux est modeste L’activité évidente de cet agent est dans les tissus. Nous sommes très intrigués par la possibilité d’utiliser la méfloquine pour augmenter l’effet de l’un des nouveaux macrolides ou comme alternative aux régimes macrolides. La méfloquine plus une fluoroquinolone, comme la moxifloxacine, et l’éthambutol ont entraîné des réductions de la charge tissulaire aussi impressionnantes que celles que nous avons documentées chez les animaux de laboratoire. pour les régimes contenant un macrolide

Modèles murins pour l’étude de la pathogenèse de Mac

Sur la base de l’expérience du modèle thérapeutique, nous avons développé au cours des années des modèles expérimentaux chez des souris qui ressemblent étroitement à l’infection MAC et à la maladie chez les patients atteints du SIDA. acquise principalement par la voie gastro-intestinale , bien que des cas associés à la voie respiratoire d’infection aient été décrits. En utilisant la souris beige, nous avons développé un modèle d’infection orale par lequel un grand ou petit inoculum de MAC est administré par gavage. La maladie en% des animaux Des études subséquentes ont montré que la capacité à provoquer une infection systémique après administration orale dépend de la souche , une observation qui correspond aux résultats chez les patients atteints du SIDA . Avoir un aperçu de la pathogénie MAC Les observations dans ce modèle ont conduit à la description de la résistance à l’acide dans le MAC L’évaluation histopathologique soigneuse après infection a montré que l’infection MAC du tractus intestinal n’est pas associée à une réponse inflammatoire significative et à une infiltration par les neutrophiles , avec des cellules inflammatoires observées ç semaines après l’infection Le processus est associé à une nécrose localisée des villosités suivie d’une cicatrisation limitée Des études supplémentaires dans ce modèle ont déterminé que MAC traverse la muqueuse intestinale principalement en envahissant les entérocytes bien que quelques bactéries aient été observées envahissant les cellules M, une caractéristique non partagée par la majorité. des pathogènes intestinaux qui traversent la barrière intestinale en envahissant les cellules M dans les plaques de Peyer Ce modèle a été montré pour être adapté à l’évaluation des régimes prophylactiques d’agents antimicrobiens contre MAC Plus récemment, un modèle murin d’infection MAC du SNC a été développé Bien que asymptomatique dans la majorité des patients, l’infection MAC du SNC a été rapporté chez un grand nombre de patients atteints de SIDA Nous avons appris que chez les souris les bactéries par millilitre de sang sont nécessaires pour provoquer l’invasion du SNC chez% des souris infectées MAC franchit la barrière hémato-encéphalique en entrant dans le Cellules du plexus chorodial mais pas des cellules endothéliales D’autres études utilisant des souris CD knockout, dans lesquelles aucune migration de cellules phagocytaires se produit dans les compartiments extravasculaires, ont confirmé que MAC n’utilise pas de monocytes pour translocation à travers la barrière hémato-encéphalique

Perspective finale

L’expérience avec la souris beige, ainsi que notre expérience avec des composés tels que la méfloquine, soulève un certain nombre de questions, y compris la question «Qu’est-ce qu’un modèle animal par opposition à un test animal? système de test plutôt qu’une véritable reproduction des maladies humaines où MAC est un agent pathogène opportuniste important La souris beige a principalement un défaut de cellules tueuses naturelles plutôt qu’une rareté absolue de lymphocytes T CD-like La question du dosage de médicaments se pose souvent en essayant de comprendre études chez l’animal Chez l’homme, la méfloquine est utilisée une fois par semaine et à une dose considérablement plus faible que la dose utilisée chez nos animaux de laboratoire. Il est toutefois bien connu que les petits rongeurs se transforment très rapidement en raison d’une augmentation du métabolisme hépatique et rénal. excrétion par rapport aux humains Trouver un facteur de correction approprié pour le dosage des expériences sur les animaux peut anticiper les résultats chez les humains, mais l’usage de ce qui semble être une dose irréaliste d’un agent Beaucoup de chercheurs ignorent le travail publié & gt; il y a des décennies, suggérant des facteurs de correction appropriés – par exemple, une souris doit recevoir une dose ç fois supérieure à la dose humaine prévue, déterminée sur la base des calculs pharmacocinétiques et de la surface spécifique. Les études expérimentales sur les animaux ont utilisé une dose beaucoup plus grande que celle que nous utilisons directement chez l’homme. Aucun clinicien ne peut sérieusement accepter comme résultat établi les résultats d’études animales en soi. L’expérimentation devrait fournir un feu vert pour l’évaluation d’un agent, quoique prudemment, chez les sujets humains Le prélude approprié pour les études animales est le criblage in vitro d’agents thérapeutiques et l’utilisation de systèmes de culture tissulaire qui imitent ce qui se passe à l’intérieur des cellules. en particulier si nous avons affaire à une infection intracellulaire Même les résultats de dépistage in vitro peuvent induire en erreur si un agent est très actif dans les tissus, s’il atteint des concentrations sériques faibles et si l’infection est due à un organisme intracellulaire qui persiste pendant des mois dans les cellules de défense de l’hôte telles que les macrophages. décourager les expériences sur les animaux à condition que la pharmacocinétique des médicaments, la pénétration dans les tissus et les données sur les concentrations intracellulaires offrent une justification convaincante pour d’autres évaluations en laboratoire

Remerciements

Nous remercions Peter Kolonoski, Martin Wu, Mary Petrofsky, Elizabeth Miltner, Sang Kim, Hsiu-Shan Wu, Joseph Goodman et Clark Inderlied pour leur précieuse collaboration au fil des ans. Nous remercions également Karen Allen pour la préparation du manuscrit