Identification d’une nouvelle série d’inhibiteurs STAT3 par criblage virtuel

Les transducteurs de signaux et les activateurs de transcription (STAT) sont une classe de protéines de facteur de transcription qui régulent la croissance cellulaire et la survie en modulant l’expression de gènes cibles spécifiques. Ils sont activés par diverses protéines de signalisation extracellulaires telles que des cytokines (par exemple IL-6) ou des facteurs de croissance. Lors de l’activation des récepteurs des cytokines ou des récepteurs du facteur de croissance, les STAT sont recrutés et phosphorylés sur un résidu tyrosine adjacent au domaine SH2 par des tyrosine kinases associées au récepteur [par exemple, Janus kinase (JAK)] ou l’activité kinase intrinsèque des récepteurs du facteur de croissance. , récepteur du facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGFR)]. Une fois activés, les STAT phosphorylés forment des homodimères ou des hétérodimères par des interactions réciproques phosphotyrosine-SH2 [c’est-à-dire, interaction protéique (PPI)], puis les dimères se transloquent au noyau, où ils se lient à leurs motifs de liaison respectifs. les éléments promoteurs des gènes cibles et induisent la transcription.1,2STATs se composent de sept isoformes (STAT1 − 4, STAT5a, STAT5b et STAT6), et parmi ceux-ci, STAT3 est considéré comme une bonne cible pour le traitement du cancer. 2 − 5 STAT3 entraîne la progression maligne des tumeurs par dérèglement de l’expression des protéines cibles, y compris les facteurs de transcription, les régulateurs du cycle cellulaire, les protéines de survie et les inducteurs de l’angiogenèse.6 De plus, l’activation constitutive aberrante STAT3 est observée dans une large On a récemment rapporté plusieurs inhibiteurs de STAT3, dont certains étaient capables d’induire l’apoptose dans les lignées cellulaires cancéreuses, c’est-à-dire le phaeosphaeride. A, 7 cucurbitacine Q, 8 CDDO-Im, 9 et 4-oxo-1-phényl-1,4-dihydroquinoléine-3-carboxylique ester.7,10 La plupart de ces composés agissent par inhibition de la signalisation STAT3; cependant, peu d’inhibiteurs de la dimérisation de STAT3 sont connus (graphique S-1). Seuls les mimétiques peptidiques, 11 STA-21,12 Stattic, 13 S3I-201 (NSC74859), 14 et 5,15-DPP15 ont été signalés comme inhibant la dimérisation de STAT3.Ici, nous rapportons l’identification de STX-0119 comme une nouvelle classe d’inhibiteurs de dimérisation STAT3 par criblage virtuel et des essais in vitro. Nous décrivons également la synthèse, la structure et les évaluations biologiques, y compris l’efficacité in vivo des dérivés STX-0119.Nous avons effectué un dépistage virtuel des inhibiteurs de la dimérisation STAT3 en utilisant CONSENSUS-DOCK, 16 une version personnalisée du DOCK417 programme, dans lequel trois fonctions de notation (DOCK4, FlexX, 18 et PMF19) et la notation par consensus20 ont été utilisées. La structure cristalline de STAT3 &#x003b2 lié à l’ADN; homo dimer (code PDB 1BG1 (21)) a été utilisé pour l’étude d’amarrage. Les résidus Ala703-Pro704-pTyr705-Leu706-Lys707-Thr708 dans la région de liaison du domaine STAT3-SH2 à partir desquels l’ADN et le partenaire de dimérisation de STAT3 ont été éliminés ont été déterminés comme étant la région d’amarrage.12,14 environ 3,6 × 105 molécules (2,7 × 105 composés). Après l’amarrage du 3.6 × 105 molécules 3D dans le domaine STAT3-SH2 en utilisant CONCENSUS-DOCK ont été complétées, nous avons sélectionné 136 composés par notation consensuelle (voir l’information de support) et inspection visuelle (pour détecter les composés qui avaient encore des liaisons hydrogène ou des interactions ioniques). conformères incorrectement contraints). Ensuite, en utilisant un test de gène rapporteur de la luciférase dépendant de STAT3 (cellules HeLa) de ces 136 composés achetés auprès de sources commerciales, nous avons identifié STX-0119 comme inhibiteur de STAT3 (99% d’inhibition à 100 ° C, tableau 1). Un analogue tronqué dépourvu du 2-Ph, STX-0872, était inactif dans ce test de gène rapporteur (pas d’inhibition à 100 ° C, M, tableau 1). Pour examiner la capacité de STX-0119 à inhiber la dimérisation de STAT3 dans les cellules, un essai de transfert d’énergie par résonance de fluorescence (FRET) 27 a été effectué. Comme le montre la figure &#x200B, la figure 1A, 1A, le prétraitement des cellules avec STX-0119 avant la stimulation de l’IL-6 a entraîné la réduction des signaux FRET. De plus, un test d’immunoprécipitation de chromatine (ChIP) de cellules MDA-MB-468 traitées par STX-0119 a révélé une réduction de l’amplification du promoteur c-myc, qui est l’une des cibles de l’activation transcriptionnelle par STAT3 (Figure (Figure 1C) .1C). Les activités inhibitrices n’étaient pas présentées par l’analogue inactif STX-0872 dans ces tests. Ces résultats suggèrent que l’activité de liaison à l’ADN de STAT3 était efficacement inhibée par STX-0119 vraisemblablement en raison de la rupture de la dimérisation de STAT3 dans les cellules. Pour évaluer davantage les effets de STX-0119 contre l’activation transcriptionnelle en aval par STAT3, nous avons étudié l’expression de ses protéines cibles dans les cellules MDA-MB-468 du cancer du sein humain. Une analyse par transfert de Western du lysat de cellules MDA-MB-468 traitées avec STX-0119 a montré que STX-0119 réduisait l’expression des protéines cibles STAT3, à savoir c-myc, cycline D1 et survivine, d’une manière dépendante de la concentration (Figure ​ (figure 1C) .1C). STX-0872, cependant, n’a pas supprimé l’expression de ces oncoprotéines régulées par STAT3 (données non présentées). Il est à noter que STX-0119 n’a aucun effet sur le niveau de STAT3 ou de STAT3 phosphorylée sur Tyr705 (figure ​ (figure 1B) .1B). Ceci suggère que STX-0119 inhibe la dimérisation de STAT3 par une interaction directe avec la protéine STAT3 et non par la modulation de régulateurs en amont tels que JAK.Figure 1Evaluation fonctionnelle de l’inhibition de STAT3 dans les cellules par STX-0119 et son analogue inactif STX-0872. (A) Essai FRET: Effet des composés sur les signaux FRET générés à partir des interactions entre STAT3-CFP et STAT3-YFP dans les cellules HEK293. (B) Test ChIP: Effet … Tableau 1Inhibition de l’activité sur la transcription STAT3 et la dimérisation STAT3Next, nous avons synthétisé N- [2- (1,3,4-oxadiazolyl)] – 4-quinoléinecarboxamide analogues (1) pour explorer les DAS de STX-0119. Les méthodes de synthèse sont décrites dans le schéma 1. La condensation du 2-amino-1,3,4-oxadiazole (6a) avec l’halogénure d’acide (3), qui a été préparé à partir de l’acide carboxylique (2) et du SOCl2 correspondants, les composés (méthode A); cependant, la purification était difficile dans plusieurs cas en raison de la formation de divers sous-produits. Une méthode alternative a été utilisée avec condensation d’acide carboxylique (2) en utilisant HATU-HOAt fournissant les composés désirés (méthode B). STX-0119 (1c) a également été synthétisé par la procédure suivante pour confirmer l’acylation attendue à la position exo-amino; Le bis (acyl) thiosemicarbazide (5), qui a été obtenu à partir d’acylisothiocyanate (4) et de 2-furoylhydrazide, a été cyclisé par TsCl dans la pyridine pour donner STX-0119 (1c) (méthode C). Les spectres de RMN et de chromatographie en phase liquide et de spectrométrie de masse étaient en accord avec les trois méthodes et le STX-0119 acheté à l’origine. De même, le STX-0119 synthétisé a présenté une activité inhibitrice similaire sur l’analyse du gène rapporteur de la luciférase dépendante de STAT3 (données non présentées). Les composés 6a et 6b ont été préparés par cyclisation de l’acylthiosemicarbazide (8) par oxydation de l’iode et de l’acide sulfurique, respectivement (Schéma S-1).Presque tous les composés synthétisés présentaient une pureté de 95%, excepté le composé lb avec une pureté de 91% (voir l’information de support) .Se 1 Préparation de composés de la série 1L’activité inhibitrice des composés synthétisés sur un test de gène rapporteur de la luciférase dépendante de STAT3. est répertorié dans le tableau 1. Parmi les analogues ayant divers 2-substituants sur le noyau de quinoléine (la − i), 1c − f ont montré un degré similaire d’activité inhibitrice, tandis que 2-H (1a) et 2-Cl (1b) étaient inactifs. Ainsi, un substituant aromatique ou encombrant à cette position est essentiel pour l’inhibition de STAT3. En outre, le remplacement du groupe 2-phényle sur le cycle quinoléine par un groupe pyridyle (1g, h) ou pipéridino (1i) a complètement aboli l’activité, suggérant que l’atome d’azote sur le cycle pyridine ou pipéridine pourrait avoir un effet négatif sur l’activité inhibitrice . En ce qui concerne le 5-substituant sur le cycle 1,3,4-oxadiazole (1j − r), les groupes 3-furyle (1q), 2-thiényle (1r), phényle (1m) et benzyle (1p) ont été tolérés . L’incorporation de 4-Cl (1o) dans l’activité du noyau phényle retenue; cependant, l’incorporation de 2-Cl (1n) rend le composé inactif. Comme les analogues avec les groupes alkyle inférieur (1j, k) et COOEt (1l) étaient inactifs, un substituant aromatique ou encombrant hydrophobe est également essentiel à cette position. De plus, le 1,3,4-thiadiazole (1s) était complètement inactif. Nous avons spéculé que la raison d’une telle différence considérable d’activité entre 1c et 1s pourrait être due à la différence conformationnelle, à savoir, une interaction unique intramoléculaire C = O · · · S pour acylamino-1, 3,4-thiadiazole.28 La plupart des composés qui ont montré une activité inhibitrice dans le test de reporteur à base de luciférase ont également inhibé la dimérisation de STAT3 dans les cellules (Tableau 1). Un modèle d’ancrage de STX-0119 lié au domaine STAT3-SH2 a été généré sur la base de la structure cristalline du STAT3 β homo dimère (code PDB 1BG1 (21)) par CONSENSUS-DOCK. Comme illustré sur la figure 2, l’anneau 2-Ph est inséré dans la fente hydrophobe où il se trouve à proximité de la poche de liaison phospho-tyrosine, fournissant une forte justification pour le manque d’activité des analogues portant un plus petit un substituant tel que H (la) ou Cl (lb) à cette position. L’amide-NH participe à une interaction de liaison hydrogène avec le squelette amide − C = O de Ser636. En outre, une interaction hydrophobe autour de l’anneau de furane et un CH − π une interaction avec le fragment indole de Trp623 est observée, conformément à la constatation que les analogues inactifs contenaient un groupe alkyle inférieur à cette position.Figure 2Dcocking modèle de STX-0119 avec le domaine STAT3-SH2 généré par CONSENSUS-DOCK. Visible par MOE. (A) Surface de la carte électrostatique. (B) Résidus de STAT3. Les atomes de carbone de STX-0119 sont colorés en jaune, et ceux du peptide phosphotyrosine (Pro704-pTyr705-Leu706-Lys707-Thr708) … Enfin, nous avons évalué l’activité antitumorale de STX-0119 in vivo. Nous avons sélectionné la lignée cellulaire de lymphome humain SCC-3 qui a été caractérisée comme une lignée cellulaire exprimant STAT3 constitutivement activé et la plus sensible à STX-0119 in vitro parmi les lignées cellulaires utilisées.29 SCC-3 a été implanté dans le flanc postérieur du mâle BALB / cA – ν / ν souris nues et autorisés à établir des tumeurs importantes. Gavages oraux de STX-0119 à 160 mg / kg sid pendant 4 jours a supprimé la croissance des cellules SCC-3 significativement (p < 0,05) le quatrième jour, comme le montre le tableau 2. L'analyse pharmacocinétique a montré que la concentration plasmatique de STX-0119 a été maintenue à > 100 μ g / mL (> 260 μ M), même à 8 h après l’administration (Informations à l’appui). Aucune perte de poids corporel ou effet toxicologique évident n’a été observé pendant l’évaluation. A notre connaissance, il s’agit de la première démonstration d’efficacité in vivo après administration orale d’un inhibiteur de dimérisation STAT3. Tableau 2: Activité antitumorale lors du traitement par STX-0119 dans le modèle de xénogreffe de lymphome SCC-3Dans cette étude, nous avons démontré qu’une combinaison de Le dépistage et les essais in vitro constituent une approche efficace pour l’identification des modulateurs de l’IPP et les inhibiteurs de STAT3 pourraient fournir une nouvelle approche thérapeutique pour le traitement du cancer. Une optimisation supplémentaire de la série de composés 1 est en cours.