Détection et quantification des norovirus aéroportés lors d’éclosions dans les établissements de santé

Contexte Les norovirus GII peuvent infecter l’homme par de multiples voies, y compris le contact direct avec une personne infectée, les matières fécales ou les vomissements, et le contact avec des surfaces contaminées Bien que le norovirus soit un agent pathogène intestinal, les aérosols pourraient: Cette étude avait pour but d’étudier la présence de bioaérosols GII de norovirus lors d’épidémies de gastro-entérites dans les établissements de santé et d’étudier les effets in vitro de l’aérosolisation et de l’échantillonnage de l’air sur les norovirus en utilisant le norovirus murin. Méthodes de substitution Un total d’échantillons d’air a été prélevé lors des poussées de norovirus dans les établissements de santé. Des échantillons ont été prélevés sur chaque patient devant la chambre du patient et au poste des infirmières. La résistance aux aérosols des bioaérosols MNV testé in vitro en utilisant une chambre d’aérosolRésultats Les génomes de norovirus ont été détectés dans les centres de santé. Les concentrations variaient de × à × génomes / m en% d’échantillons d’air. MNV- a préservé son infectiosité et son intégrité lors d’études in vitro sur les aérosolsConclusions Les génomes de norovirus sont fréquemment détectés dans l’air des établissements de santé. En outre, des modèles in vitro suggèrent que ce virus peut résister à l’aérosolisation

norovirus, transmission aérienne, chambre GenaMini, infection nosocomialeLes norovirus sont des virus à ARN monocaténaire non enrobés appartenant à la famille des Caliciviridae. Ils sont la cause la plus fréquente de gastro-entérite épidémique, responsable d’au moins% des cas de gastro-entérite dans le monde. Les cas de gastro-entérite surviennent principalement dans des établissements où l’hygiène est compromise et où le contact entre les patients infectés et le personnel est intense, comme dans les hôpitaux et les maisons de retraite . Les enfants, les personnes âgées, les personnes immunodéprimées et les personnes vivant ou travaillant dans des établissements de soins de santé courent un risque plus élevé de contracter la maladie Les norovirus sont des infections à norovirus qui représentent des millions de consultations externes, des hospitalisations et des décès chaque année. hautement contagieux, avec une dose infectieuse allant de Une étude descriptive réalisée pour estimer l’incidence des foyers de norovirus dans les hôpitaux et maisons de retraite de Catalogne (Espagne) a démontré que les norovirus étaient très élevés et associés à une mortalité importante [ ], et a montré que même une faible quantité de contamination peut entraîner un risque potentiel pour la santé publique Des voies multiples de transmission de l’infection ont été documentées, notamment un contact direct avec une personne infectée, des matières fécales et / ou des gouttelettes de vomitus. contact avec des surfaces contaminées Des preuves indirectes suggèrent que le norovirus pourrait être transmis par voie aérienne, et cette voie de transmission a déjà été suggérée dans la littérature Nenonen et al ont montré une forte similarité nucléotidique entre souches de norovirus GII présentes dans la poussière de chambres de patients infectés par norovirus Cependant, norovirus n’a jamais été détecté dans l’air des hôpitaux en dehors du patient Le potentiel infectieux des norovirus aéroportés n’a jamais été étudié car ce virus était, jusqu’à très récemment, non cultivable . L’évaluation de la capacité du norovirus à résister au stress associé à l’aérosolisation est essentielle pour étudier son potentiel de dissémination aéroportée. des modèles ont été développés pour évaluer la persistance de l’infectiosité des norovirus dans l’environnement, et des substituts pour les norovirus humains sont utilisés: calcivirus félin, bactériophage MS et norovirus murin MNV norovirus murin type MNV- partage des caractéristiques génétiques et structurales similaires à celles du norovirus humain et est donc un substitut cultivable et est utilisé pour étudier la résistance au stress environnemental du norovirus humain Un virus est généralement considéré comme infectieux si son intégrité est documentée Ces dernières années, une nouvelle technique, le propidium monoazide PMA, a été développé pour évaluer l’intégrité structurale des micro-organismes et différencier intact et membrane-compromise Il s’agit d’un colorant intercalant ADN / ARN avec un groupe azoture photoinductible, qui permet des liaisons transversales covalentes après une exposition à la lumière. Dans les études de virologie, le PMA pénètre seulement les virus avec une capside endommagée et peut donc différencier intactes des virions compromis. Cette méthode a été utilisée pour déterminer l’intégrité des particules de norovirus L’objectif général de cette étude était d’étudier le potentiel de transmission aérienne de norovirus humain. Pour atteindre cet objectif, des objectifs distincts et complémentaires ont été conçus: quantifier la présence de norovirus GII dans les prélèvements d’air lors des épidémies de gastro-entérites dans les établissements de santé et étudier la résistance du virus à l’aérosolisation en évaluant son intégrité lorsqu’il est soumis à un stress aérosol in vitro en utilisant le MNV comme substitut. l’utilisation d’une méthode quantitative de PCR qPCR de PMA comme indicat ou de l’intégrité MNV a également été validée

MATÉRIAUX ET MÉTHODES

Domaine d’étude

Échantillonnage du norovirus humain dans les établissements de santé

L’échantillonnage de l’air a été effectué dans les établissements de santé de la région de Québec au Canada lorsque des éclosions de gastro-entérite virale sont survenues. Le norovirus a été établi par PCR comme agent causal des éclosions de gastro-entérite par le laboratoire de santé publique de la province de Québec. à l’intérieur de la salle des patients présentant des symptômes de gastro-entérite & lt; heures, dans les couloirs ou la salle commune à l’extérieur des chambres des patients présentant des symptômes, et au poste des infirmières Un total d’échantillons d’air a été prélevé: des chambres des patients, des couloirs / aires communes et des postes d’infirmières. avec le Coriolis μ Bertin Technologies, St-Berthely, France réglé à L / minute pour l’échantillonneur minutes D & lt; μm et mL de PBS saline tamponnée au phosphate ont été utilisés pour la collecte des fluides Lonza, Bâle, Suisse Les échantillons ont été concentrés sur une porosité de l’unité de filtration Ultra-centrifuge Amicon de kDa; Millipore, Billerica, Massachusetts jusqu’à un volume final de μL Des échantillons d’air concentré ont été enrichis avec μL d’un génome de suspension de bactériophage MS / mL en tant que contrôle interne pour l’extraction de l’ARN et qPCR

Isolement de l’ARN des norovirus humains

L’ARN viral a été isolé en utilisant le kit d’isolation d’ARN viral MagMax Life Technologies, Carlsbad, Californie. L’ARN total a été élue et immédiatement transcrit en ADNc d’ADN complémentaire ou congelé à – ° C jusqu’à ce que la PCR de transcription inverse soit effectuée.

Expériences in vitro

Norovirus murin et cellules

Des cellules RAW de MNV et de macrophage ont été cultivées comme mentionné par Wobus et al., En présence de macrophages RAW dans du milieu DMEM de Eagle modifié par Dulbecco; Cellgro, Mediatech, Herndon, Virginie Un stock initial d’unités PFU / mL formant plaque a été préparé, divisé en sous-échantillons mL de MNV- à PFU / mL pour chaque expérience, puis conservé à – ° C.

MNV- Aérosolisation

L’aérosolisation a été réalisée dans une chambre d’aérosol GenaMini, SCL Medtech Inc., Montréal, Canada Soixante-cinq millilitres de MNV-PFU / ml dans du DMEM ont été atomisés à jet unique nébulisés, modèle; TSI Inc, Shoreview, Minnesota, au taux de L / minute utilisant de l’air filtré HEPA à haute efficacité Le débit moyen du nébuliseur était de ± mL par minute. Les aérosols étaient séchés dans un dessiccateur. EMD Chemicals Inc, Gibbstown, New Jersey , permettant la formation de noyaux de gouttelettes avant d’entrer dans la chambre, et ont été dilués avec de l’air sec filtré par HEPA à un taux de L / minute Un modèle de Sizer Aérodynamique des Particules; TSI Inc a été utilisé pour surveiller la distribution granulométrique et la concentration lors de l’échantillonnage des aérosols. La température et l’humidité relative HR ont également été mesurées

Échantillonnage d’aérosol

Des échantillons d’air ont été prélevés à l’aide du prototype d’échantillonneur d’aérosol à cyclone NIOSH de l’Institut national pour la sécurité et la santé au travail NIOSH-; Centres pour le contrôle et la prévention des maladies [CDC] / NIOSH, Morgantown, Virginie occidentale minutes à la minute, puis les particules ont été éluées du premier stade et du filtre en utilisant du PBS ml et du second stade avec du PBS un agitateur orbital WIS Biomed, San Mateo, Californie pendant quelques minutes à température ambiante Tous les éluants ont été regroupés Les expériences d’aérosolisation ont été réalisées fois La culture virale, l’extraction d’ARN et la synthèse d’ADNc ont été effectuées le même jour que les expériences d’aérosolisation

Quantification par Plaque Assay

Les dosages de plages ont été réalisés comme décrit précédemment par Gonzalez-Hernandez et al , sauf que les plaques ont été visualisées par coloration au cristal violet après fixation avec du formaldéhyde. Chaque essai de plaque avait un puits témoin négatif.

ARN Isolement de MNV

L’ARN viral total a été extrait à l’aide du kit QIAamp viral RNA Mini Qiagen, Mississauga, Ontario, Canada L’ARN total a été élué dans un ul de tampon d’élution, fourni avec le kit.

Quantification du génome viral

Synthèse d’ADNc du génome viral

L’ARN a été converti en ADNc en utilisant le kit de synthèse d’ADNc iScript Bio-Rad, Hercules, Californie, en suivant les instructions du fabricant.

Quantification des virus par qPCR

Des réactions séparées ont été réalisées pour la détection du contrôle interne de la SEP, des norovirus GII humains provenant d’échantillons d’air prélevés sur le terrain et du MNV provenant d’échantillons d’air étudiés in vitro. Les génomes MS ont été détectés en utilisant qPCR décrit ailleurs. L’extraction de l’ARN et la synthèse de l’ADNc étaient efficaces. La détection de l’ADNc de norovirus GII et de MNV- a été réalisée en utilisant qPCR comme décrit par Kageyama et al et Girard et al respectivement, Quantification en utilisant une courbe standard d’une série de dilutions Préparation de l’ADN plasmidique ou norovirus Préparation de l’ADN plasmidique GII On a utilisé des dilutions en série à partir de molécules par tube réactionnel. La courbe a été préparée en utilisant les kits pGC de clonage et d’amplification Lucigen, Middleton, Wisconsin Les plasmides ADN ont été purifiés en utilisant le Qiagen Plasmid Mini Kit et ont été quantifiés avec un spectrophotomètre NanoDrop Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts

Dosage PMA-qPCR

La méthode PMA-qPCR, précédemment utilisée avec norovirus par Parshionikar et al , permet la quantification du virus avec une capside intacte. PMA Biotium Inc, Hayward, Californie a été dissous dans du diméthylsulfoxyde pour créer une solution mère mM et stockée à – ° C dans l’obscurité Un total de μL de PMA a été ajouté à μL d’aliquotes d’échantillon d’air jusqu’à une concentration finale de μM dans des tubes transparents -mL Fisher Scientific, Ottawa, Ontario, Canada Après une période d’incubation de quelques minutes dans l’obscurité , les échantillons ont été exposés à la lumière pendant des minutes à l’aide d’un dispositif de photolyse à DEL à diode électroluminescente PMA-Lite, une DEL à longue durée de vie avec des émissions de – nm pour l’activation du PMA; Biotium Inc L’extraction d’ARN viral a été réalisée comme mentionné précédemment en utilisant le QIAamp viral RNA Mini Kit Qiagen, Mississauga, Ontario, Canada

RÉSULTATS

Domaine d’étude

Des génomes de Norovirus GII ont été détectés dans des échantillons d’air provenant des établissements de santé% et des échantillons d’air Des ARN de norovirus ont été détectés dans les chambres des patients symptomatiques%, des couloirs% et des postes d’infirmières% Concentrations d’échantillon positives / m Table

Tableau Détection et concentration de l’ARN GII de Norovirus récupéré de l’air dans les salles de patients, couloirs et postes de soins durant les éclosions confirmées de Norovirus-Québec, Emplacement du Centre de soins de santé Nombre d’échantillons positifs détectés dans l’air du Norovirus GII, Genomes / m × – × Postes d’infirmières / × – × Couloir / aires communes / × – × Emplacement du centre de soins de santé Nombre d’échantillons positifs détectés dans l’aire de répartition des norovirus GII, génomes / m Chambres des patients / × – × Couloir / aires communes / × – × Des échantillons d’air ont été prélevés avec le Coriolis μ, réglé à L / minute pour les minutesView Large

Expériences in vitro

Pour toutes les expériences, le diamètre aérodynamique médian des aérosols dans la chambre GenaMini variait de μm à μm et la concentration totale de particules était de × à × particules / cm. L’HR et la température varient dans la chambre entre%% et ° C ° C La concentration de virus infectieux, de génomes totaux et de virus à structure intacte dans le nébuliseur de la chambre d’aérosol n’a pas varié de manière significative entre le début et la fin du processus d’aérosolisation. Les concentrations de MNV dans le nébuliseur étaient des particules virales infectieuses / mL Figure A, – × particules de virus intactes / mL Figure C, et – × génomes / mL Figure B, déterminée par dosage de plages, qPCR, et PMA-qPCR, respectivement

Figure View largeTélécharger la lameMurine norovirus type Concentrations MNV- unités formant plaque [PFU] dans le nébuliseur au début des barres noires et à la fin des barres grises de l’aérosolisation A, Infectious MNV- concentration B, MNV- génome concentration C, Concentration de MNV – avec capside virale intacte Il n’y a pas de différence significative entre la concentration virale au début et à la fin de l’aérosolFigure View largeTélécharger la diapositiveMurine norovirus de type MNV- concentrations unités formant des plaques [PFU] dans le nébuliseur au début des barres noires et à la fin barres grises de l’aérosolisation A, concentration MNV-infectieuse B, concentration du génome MNV- C, concentration de MNV- avec capside virale intacte Il n’y a pas de différence significative entre la concentration virale au début et à la fin de l’aérosolisationUtilisation de PMA-qPCR, Il est possible de déterminer le pourcentage relatif de MNV intact dans le NIOSH. La figure montre que le virus NIOSH récupéré est intact. Le rapport cultivable-génome dans le nébuliseur et l’échantillonneur a été calculé et le résultat a été converti en pourcentage pour déterminer la résistance du norovirus à l’aérosolisation et à l’échantillonnage de l’air. Le pourcentage relatif d’infectiosité MNV varie de% à%. NIOSH – était efficace pour préserver l’infectiosité du virus MNV

Figure Vue largeDownload slideRelatif pourcentage de norovirus murin de type MNV- avec capside intacte après aérosolisation et échantillonnage avec l’Institut national pour la sécurité et la santé au travail – prototype de l’échantillonneur d’aérosol à cyclone NIOSH-; cercles noirs tels que déterminés à l’aide du monoazide de propidium Dosage polymérase en chaîne par polymérase PMA Quotient infectieux MNV- après aérosolisation et échantillonnage avec les triangles noirs NIOSH Les barres horizontales représentent la moyenne des expériences avec écart-typeFigure View largeDownload slideRelatif pourcentage de norovirus murin de type MNV- avec intacts capside après aérosolisation et échantillonnage avec l’Institut national d’hygiène et de sécurité au travail – prototype d’échantillonneur d’aérosol à cyclone NIOSH-; cercles noirs tels que déterminés à l’aide du monoazide de propidium Test de polymérase en chaîne par polymérase PMA Pourcentage infectieux relatif de MNV après aérosolisation et échantillonnage avec les triangles noirs NIOSH Les barres horizontales représentent la moyenne des expériences avec écart-type

DISCUSSION

Cette étude fournit des données quantitatives originales concernant la dissémination aéroportée du norovirus dans les établissements de santé et documente, pour la première fois, la dissémination généralisée du norovirus humain GII dans l’air des établissements de santé lors des épidémies de gastro-entérites. pas de norovirus humain dans l’air, mais simplement que la limite de détection du test a été atteinte L’air des chambres des patients peut contenir jusqu’à des génomes / m, et en considérant qu’un humain moyen respire environ 1 L d’air par minute, un agent de santé peut inhaler Jusqu’à quelques copies de norovirus humain pendant un séjour -minute dans la chambre d’un patient symptomatique Pour certains individus, cette quantité pourrait être suffisante pour causer la maladie. De nombreux processus peuvent conduire à la création d’aérosols de norovirus, et plusieurs sources peuvent être identifiées comme la resuspension des fomites , des toilettes à chasse d’eau , des gouttelettes de vomitus , et des travailleurs de la santé au service comme vecteur pour les particules aérosolisées Toutes ces sources doivent être considérées pour éviter les épidémies Dans l’ensemble, la détection de concentrations significatives de génomes de norovirus humains dans l’air des corridors et des postes de soins suggère qu’ils peuvent rester en suspension pendant de longues périodes. Ceci confirme l’hypothèse selon laquelle le norovirus humain pourrait être une maladie aéroportée comme le suspectent Sawyer et al Bien que le norovirus soit un pathogène intestinal, les norovirus pourraient être transmis par voie aérienne et pourraient ensuite, s’ils sont inhalés, se déposer dans le pharynx. Nous avons ensuite réalisé des études in vitro pour évaluer la préservation du potentiel infectieux du norovirus en aérosol en utilisant le MNV comme substitut et un échantillonneur NIOSH-air. Les norovirus pourraient résister à l’aérosolisation sans perte significative d’infectiosité. La différence entre les concentrations de virus infectieux et les virus intacts pourraient être expliqués par la présence de dommages Les méthodes de culture des norovirus humains n’ayant été publiées que récemment après la fin de cette étude, nous suggérons que l’échantillonneur NIOSH pourrait être utilisé. sur le terrain pour évaluer la cultivabilité et l’infectiosité des virus humains en suspension dans l’air Ces résultats peuvent expliquer en partie la propension de ce virus à provoquer des épidémies soudaines et généralisées dans les milieux de soins et les milieux confinés. Marks et al ont également soulevé la possibilité d’une propagation aéroportée de norovirus suite à des infections par inhalation dans les hôtels, restaurants et écoles Les résultats présentés dans ce rapport pourraient avoir un impact important sur les pratiques de contrôle des infections et les recommandations Ils suggèrent que l’air peut être un mode important mais encore sous-estimé de transmission du norovirus et d peut expliquer en partie la difficulté bien connue du contrôle des poussées de norovirus Actuellement, le CDC recommande la mise en place de précautions de contact uniquement pour les patients souffrant de gastro-entérite à norovirus Cette recommandation repose sur la conviction que les norovirus sont peu viables les courants qui parcourent de longues distances Il est nécessaire d’identifier les mesures optimales de prévention des infections nécessaires pour assurer la sécurité de l’environnement hospitalier; par exemple, l’utilisation de précautions aéroportées complètes, y compris l’utilisation de respirateurs, la fermeture des chambres des patients et l’utilisation de chambres à pression négative pourraient aider à prévenir la transmission de ce virus gênant. En conclusion, cette étude a détecté des concentrations élevées de norovirus infectieux. l’air des établissements de soins de santé pendant les éclosions Les modèles in vitro suggèrent que ce virus peut résister à l’aérosolisation, ce qui soutient un mode probable de transmission du norovirus

Remarques

Remerciements Nous remercions la Table régionale de prévention des infections nosocomiales de la région de nous avoir informés de la survenue d’une éclosion. Nous remercions également le Dr M C Roy et le Dr J Villeneuve de nous avoir aidés à recruter des centres; tous les patients ayant participé à cette étude; L Trudel pour la lecture critique de ce manuscrit; et JE Marcoux pour la révision en anglais. Soutien financier Ce travail a été soutenu par le numéro de subvention de l’Institut de Recherche Robert-Sauvé en Santé et Travail – et le numéro de subvention du Conseil national des sciences et de génie du Canada, RGPIN. CD est un Fonds de recherche du Québec – Santé Chercheur FRQ-S et membre du FRQ-S Réseau de santé respiratoire YL est un chercheur en recherche clinique financé par le FRQ-SConflits d’intérêts potentiels Tous les auteurs: Aucun conflit signaléTous les auteurs ont soumis le Formulaire ICMJE pour la divulgation du potentiel Conflits d’intérêts Les conflits que les éditeurs jugent pertinents pour le contenu du manuscrit ont été divulgués