Découverte des inhibiteurs de la S-nitrosoglutathione réductase: agents potentiels pour le traitement de l’asthme et autres maladies inflammatoires

La réaction du glutathion avec des espèces réactives de l’azote confère au S-nitrosoglutathione (GSNO) un métabolite majeur de l’oxyde nitrique (NO). La S-Nitrosoglutathione réductase (GSNOR), un membre de la famille des alcools déshydrogénases (ADH), 2 On a montré que les S-nitrosothiols (SNO), une classe biologiquement importante d’adduits stables à base de NO, en réduisant la GSNO.3 GSNO, provoquent de nombreuses fonctions biologiques du NO et servent également de dépôt durable pour le NO, qui a un court cycle biologique. demi-vie.4 Les augmentations de NO biodisponibles sont associées à des effets anti-inflammatoires et relaxants des muscles lisses, en particulier dans les systèmes d’organes caractérisés par des couches musculaires lisses et endothéliales / épithéliales telles que les systèmes respiratoire, cardiovasculaire et gastro-intestinal5. Dans des conditions normales, le NO et le GSNO peuvent maintenir la fonction pulmonaire grâce à leur influence sur le tonus des muscles lisses bronchiques et les activités anti-inflammatoires.9,10 Dans l’asthme humain, les concentrations de SNO dans les poumons sont réduites, probablement Les souris présentant une délétion génétique du GSNOR présentent une augmentation des SNO pulmonaires et sont protégées contre l’hyperréactivité bronchique.11 Chez ces souris, il a été démontré que GSNOR a une influence importante sur les espèces contenant du NO, la régulation des muscles lisses tonus dans les voies respiratoires, et la fonction des récepteurs adrénergiques dans les poumons et le cœur.5,8,12 GSNO joue également un rôle important dans l’infla la maladie intestinale mmatory (IBD). Le NO et le GSNO maintiennent une physiologie intestinale normale par des actions anti-inflammatoires et le maintien de la barrière des cellules épithéliales intestinales. Dans les MII, des niveaux réduits de GSNO et de NO sont évidents et peuvent également survenir par une régulation positive de l’activité GSNOR13. Compte tenu de ces résultats, GSNOR est apparue comme une cible potentiellement importante pour le traitement des maladies respiratoires, cardiovasculaires et gastro-intestinales. N30 Pharmaceuticals a lancé un effort de découverte visant à identifier les inhibiteurs à petites molécules du GSNOR par le criblage à haut débit de composés disponibles dans le commerce, suivi d’une optimisation de la protéine basée sur la structure. Le but de l’effort était d’identifier les inhibiteurs de GSNOR puissants qui peuvent être administrés par voie intraveineuse (IV) ou par voie orale (PO) pour traiter ces maladies. Dans cet article, nous rapportons des inhibiteurs puissants de GSNOR avec IC50 nanomolaire faible, qui ont démontré l’efficacité in vivo et l’innocuité dans les modèles précliniques et ont avancé dans le développement clinique. Nous décrivons également la structure et les relations d’activité des inhibiteurs GSNOR et la structure cristalline d’un complexe inhibiteur de l’enzyme NAD + et nous rapportons quelques propriétés biologiques et pharmacologiques initiales de ces inhibiteurs. La majorité des inhibiteurs GSNOR Les autres composés ont été synthétisés selon les schémas 1 et 2. D’autres composés ont été synthétisés en utilisant les méthodes décrites dans le document Information complémentaire.Schéma 1 Synthèse des inhibiteurs GSNOR Dans le schéma 1, la condensation de la cétone 1 et 2-furanaldéhyde a donné l’intermédiaire 2 avec un rendement élevé.16 La formation de pyrrole a été réalisée par condensation de dicétone 3 et d’anilines dans des conditions acides18. L’hydrolyse de l’intermédiaire 4 par NaOH dans de l’alcool a donné les produits finaux 5a et # x02212; 5j in 5 − 15% rendement global.Schéma 2Alternate Synthèse des inhibiteurs GSNORCompounds avec variations structurelles sur le pH Le cycle ényle à la position C-5 du cycle pyrrole a été synthétisé selon le schéma 2. La condensation du 4-amino-3-méthylbenzamide avec le 2,5-diméthoxytétrahydrofurane dans AcOH a conduit à la formation d’un pyrrole intermédiaire clé. 6.19 Formylation du pyrrole anneau de 6 dans les conditions de Vilsmeier produit 7 en bon rendement. L’acrylate 8 a été obtenu par une réaction de Wittig à 7 avec du (carbéthoxyméthylène) triphénylphosphorane20 ou réaction de l’aldéhyde 7 avec du monoéthylmalonate de potassium et du DMAP dans du DMF suivi de l’addition de AcOH et de pipéridine.21 L’hydrogénation de l’acrylate 8 à l’aide de Pd / C ester 9, dont la bromation aboutit au bloc de construction clé 10.22 Dérivatisation de 10 avec une variété d’acides boroniques ou d’esters dans des conditions Suzuki fournie intermédiaire 11.23 Le nitrile 11 a été converti en amide 12 par K2CO3 en présence de H2O2 dans du DMSO. L’hydrolyse finale dans des conditions basiques a donné 13a, avec des rendements globaux de 5%. Les inhibiteurs de GSNOR rapportés ici se lient de manière réversible à la poche de liaison de HMGSH.24 Bien que les structures des complexes apo, binaire et ternaire de GSNOR ont été publiés, 25 aucune structure cristalline du complexe GSNO & GSNOR n’a été rapportée. Pour guider la conception et l’optimisation des inhibiteurs GSNOR, les structures des inhibiteurs liés à GSNOR et NAD + ont été déterminées par cristallographie aux rayons X. La structure cristalline du complexe ternaire de GSNOR, NAD + et N6022 a été résolue à 1,9 Å (Figure ​ (Figure1) 1) (code pdb: 3QJ5).Le complexe enzyme-ligand cristallisé comme homodimère avec N6022 se liant à chaque monomère GSNOR par les interactions clés suivantes: (1) l’imidazole dans l’inhibiteur interagit avec l’un des zincs structurels, qui est également coordonné à l’histidine 66, la cystéine 44 et la cystéine 173 pour former le tétraèdre de coordination du zinc; (2) l’acide carboxylique de N6022 se lie à la glutamine 111 et forme un pont salin avec l’arginine 114 et la lysine 283 du second monomère; (3) les liaisons hydrogène carboxamide N6022 à la glutamine 117; (4) l’anneau d’imidazole N6022 forme un π − π interaction avec le noyau nicotinamide de NAD +. Figure 1: Structure directe de N6022 liée au complexe NAD + de l’enzyme GSNOR (a) et de la poche de liaison GSNOR de N6022 (b) .Tableaux 1SAR et PK Propriétés des inhibiteurs GSNOR Composé 5a (GSNOR IC50 = 570 nM), qui a été identifiée en criblant une bibliothèque de composés disponibles dans le commerce, a été le point de départ de l’optimisation du plomb basée sur la capacité à inhiber l’activité de GSNOR in vitro (Tableau 1). L’introduction d’un groupe méthyle à la position R3 du cycle N-phényle comme indiqué dans le schéma 1 a entraîné une légère amélioration de IC50 de 570 nM à 360 nM (5b). La substitution en position 4 du cycle C5-phényle (R1) avec un groupe méthoxy a également amélioré la CI50 jusqu’à 460 nM (5c). IC50 = 210 nM a été atteint en combinant les deux fonctionnalités (5f). Structure − relations d’activité (SAR) impliquant des substituants à la position R3 ont été explorées plus loin en remplaçant le groupe méthyle par des halogènes (5d et 5e) ou un groupe trifluorométhyl (14). Une activité légèrement améliorée a été observée pour l’analogue chloré 5e. La position R1 a été examinée plus avant par substitution avec divers groupes. Des augmentations subtiles de la puissance ont été obtenues pour les analogues du chloro 13b, du bromo 13c et de l’hydroxyl 5h. Une amélioration significative a été réalisée en substituant la position R1 par l’imidazole, conduisant à N6022 avec IC50 de 20 nM. La puissance accrue de N6022 peut s’expliquer par le fait que l’imidazole interagit avec l’un des Zn structurels dans GSNOR (Figure 1) .1). D’autres fragments potentiels de liaison au Zn, y compris les hétérocycles, ont été explorés, mais l’imidazole semble être le meilleur. Les SAR impliquant des substituants du cycle C5-phényle ont été explorés en remplaçant les positions ortho et para (tableau 1). Dans la plupart des cas, la position R1 a été substituée avec du chlore pour comparaison et R2 a été exploré pour son effet sur IC50 et les propriétés pharmacocinétiques. Lorsque R2 était un méthoxy (16), IC50 = 56 nM a été atteint. L’échange de la position des deux groupes a entraîné une perte significative de puissance (IC50 = 200 nM, 13e). L’analogue bromo (17) du composé 16 a également une CI50 basse (96 nM). L’analogue hydroxyle 5j a une activité similaire à celle de son comparateur de méthoxy 16. L’augmentation de la taille du groupe alcoxy en position R2 a entraîné une réduction de 3 fois de la puissance (18 et 19). Les groupes contenant de l’azote simples n’améliorent pas l’activité inhibitrice (13f, 20 et 21). Ni la disubstitution avec les halogènes (13g et 13h), ni l’activité inhibitrice du CF3 (13i). Table 2SAR des inhibiteurs de GSNOR contenant du tétrazoleEn raison de la responsabilité métabolique potentielle des acides carboxyliques, ce groupe a été remplacé par un fragment tétrazole (Figure 2). Figure 2,2, Tableau 2), un bioisostere couramment utilisé pour l’acide carboxylique, 26 se connectant à travers le carbone du cycle tétrazole.Les données dans le tableau 2 démontrent que l’acide carboxylique peut être remplacé sans une énorme perte de puissance, en particulier lorsque R1 était bromo (24) comparé à son homologue acide carboxylique 13c (CI50 = 160 nM) ou R1 était le groupe N-imidazole (28 et 29) La longueur de la chaîne liant le pyrrole et le tétrazole (Figure 2) 2) ont joué un rôle critique: lorsque R1 était un groupe relativement petit (par exemple, méthoxy et bromo), une meilleure inhibition était obtenue avec des chaînes alkyles plus longues (22, 24 et 26). imidazole, la longueur de chaîne plus courte était préférable ed (29), en raison de la restriction de taille dans la poche de liaison.Figure 2 Structures de tétrazole contenant des inhibiteurs de GSNOR.Plusieurs composés ont été sélectionnés pour des études pharmacocinétiques chez la souris. La biodisponibilité orale des composés testés variait de 2,72% à 86,5% (Tableau 1), et la clairance plasmatique (LC) après administration intraveineuse variait de 8,9 à 37,8 mL / min / kg. Le composé 5a a démontré une bonne biodisponibilité orale (86,5%), bien que la puissance ait été médiocre. Malgré la puissance élevée du N6022, sa biodisponibilité orale était très faible (4,4%), avec une clairance élevée (37,8 mL / min / kg), potentiellement due à la forte polarité de l’imidazole. Le composé 16 était l’analogue non-imidazole le plus puissant, avec une biodisponibilité orale de 22%. Une batterie de tests in vitro a été utilisée pour évaluer l’activité hors cible potentielle des inhibiteurs de GSNOR sur 54 récepteurs transmembranaires et solubles, canaux ioniques et des transporteurs de monoamine.Les effets hors-cible ont été estimés à partir du pourcentage d’inhibition de la liaison du radioligand du récepteur à une concentration de 10 « M du composé d’essai. Une activité hors cible limitée a été observée vers le récepteur opiacé δ 2 pour N6022 (66% d’inhibition); aucune autre activité hors cible potentielle n’a été détectée. Les composés sélectionnés ont également été criblés pour la cytotoxicité vis-à-vis des cellules pulmonaires épithéliales A549. Une cytotoxicité minimale (IC50 > 100 μ M) a été observée en utilisant ce test. Les composés sélectionnés ont également été criblés dans des dosages du cytochrome P450. Tous les composés criblés dans ces dosages présentaient une inhibition minimale à la concentration du composé M de 10 ° C, à l’exception de N6022, qui avait une CI50 de 0,77 & mgr; M pour le CYP2C19. N6022 était négatif dans un criblage hERG in vitro (> 100 μ M) et n’a montré aucun signe de mutagénicité dans un criblage mutagène bactérien. Les inhibiteurs GSNOR sélectionnés ont été testés dans des études toxicologiques de 5 jours chez la souris. Les composés ont été administrés à des souris par voie IV ou PO. Les inhibiteurs sélectionnés ont été bien tolérés. Les concentrations sans effet nocif observé (DSENO) pour l’administration intraveineuse de N6022, 5f et 13c étaient respectivement de 30, 50 et 50 mg / kg / jour. La NOAEL pour l’administration de N6022 par PO pendant 5 jours était de 100 mg / (kg jour) .27L’efficacité des inhibiteurs de GSNOR a été évaluée dans des modèles animaux d’asthme et d’autres maladies inflammatoires influencées par une GSNOR dérégulée. Dans un modèle murin d’asthme induit par l’ovalbumine, 28N6022 atténue la bronchoconstriction induite par la méthacholine (hyperréactivité bronchique) d’une manière dépendante de la dose et du temps, avec une efficacité significative obtenue avec une seule dose intraveineuse et 0,01 mg / kg de 30 min à 48 h avant le défi de la méthacholine. N6022 a également significativement atténué l’infiltration des éosinophiles dans les poumons avec une seule dose intraveineuse. Dans un modèle murin d’IBD induite par le DSS, N6022 a démontré une efficacité significative avec des doses orales ou intraveineuses à 1 et 10 mg / kg / jour pendant 10 jours. L’efficacité des inhibiteurs 5j, 5f, 13c et 16 a été évaluée en utilisant un ou plusieurs des modèles murins d’asthme induit par l’ovalbumine, de BPCO induite par l’élastase pancréatique porcine (PPE), de MICI induite par le DSS et d’un modèle alimentaire élevé. hypertension induite par le sel (DAHL / S). Une efficacité significative a été observée dans tous les modèles.30 − 32Ces données suggèrent que les inhibiteurs de GSNOR ont un potentiel en tant qu’agents thérapeutiques pour moduler l’activité de GSNOR et atténuer les pathologies médiées par GSNOR in vivo. Ainsi, N6022 est avancé dans les études précliniques et est actuellement dans les essais cliniques de phase I pour le traitement de l’asthme aigu. D’autres composés décrits dans ce rapport sont en cours d’évaluation pour le traitement d’autres types de maladies induites par GSNOR. En résumé, l’optimisation de la sonde basée sur la structure a conduit à un certain nombre d’inhibiteurs GSNOR puissants avec des propriétés pharmacologiques favorables dans plusieurs modèles de maladies. Nous avons identifié un inhibiteur puissant et réversible de la GSNOR N6022, qui a démontré une excellente activité in vivo dans le modèle animal de l’asthme induit par l’ovalbumine. Ce composé a également démontré un profil d’innocuité acceptable dans les évaluations toxicologiques non cliniques. Le N6022 est actuellement en cours de développement pour son potentiel clinique à traiter l’asthme aigu.