Allergiques IGF-1R

Les indications médicales à long terme nécessitent des traitements médicamenteux à long terme avec un profil de toxicité bien toléré. Cela a été compris pour le traitement de maladies telles que l’hypertension artérielle et est maintenant également réalisé dans des maladies potentiellement mortelles, telles que le cancer.1 La sélectivité et la spécificité des médicaments correspondants sont donc essentielles. Les kinases sont impliquées dans de nombreuses cascades de signalisation cellulaire cruciales et ont été impliquées dans l’oncogenèse et la progression tumorale à travers leur régulation aberrante ou leur surexpression. De nombreux médicaments sur le marché ou en développement clinique inhibent les kinases.2 L’inhibition de la kinase par la compétition ATP (type I) est associée à des obstacles de sélectivité dus à la conservation de séquences élevées dans la poche de liaison à l’ATP dans le kinome. Cependant, la variabilité conformationnelle des kinases permet une inhibition allostérique en ciblant les sites non-ATP (type II / III). De tels sites de liaison allostérique sont moins fréquents dans les structures de protéine kinase à travers le kinome, offrant une approche très prometteuse pour atteindre l’objectif de sélectivité.3 Il y a seulement quelques rapports publiés d’inhibiteurs de kinases qui ne sont pas ATP et / ou compétitifs. Après l’identification initiale de SB-203580, un inhibiteur spécifique de la sérine / thréonine kinase p38 MAPK (mitogen-activated protein kinase), 4 qui interagit avec des résidus d’acides aminés en dehors de la poche de liaison ATP, des composés supplémentaires pour p38,5 PLK1, 6 GSK-3,7 Akt, 8 et MEK9 ont été rapportés, mais seulement quelques-uns d’entre eux pourraient démontrer expérimentalement l’interaction allostérique. Le récepteur du facteur de croissance insulinomimétique I (IGF-1R) est un membre du récepteur tyrosine famille de kinases.10 Les peptides IGF-1 et IGF-2 sont les ligands activateurs apparentés de l’IGF-1R.11 Plusieurs lignées de preuves épidémiologiques et mécanistiques relient l’activation et la signalisation de l’IGF-1R à la biologie tumorale.12 Rapports récents de l’IGF-1R de Pfizer l’anticorps CP-751871 (actuellement en essais cliniques) soutient l’hypothèse que l’inhibition de l’IGF-1R a un effet bénéfique sur la progression de la maladie chez les patients cancéreux et pourrait fournir une preuve de concept pour cette cible13. Le récepteur de l’insuline est un récepteur apparenté yrosine kinase et partage une identité de séquence élevée de 84% dans le domaine tyrosine kinase avec IGF-1R.17 Cette homologie rend très difficile de cibler sélectivement l’un des récepteurs et signifie un défi particulier pour la conception de l’inhibiteur de l’IGF-1R.18 Dans ce contexte, il est intéressant de constater que le repliement global des domaines catalytiques des protéines kinases est très similaire sous forme totalement activée, alors qu’il existe des différences frappantes entre les différentes conformations inactives de différentes sous-familles de kinases19. 20Ceci est également vrai pour l’IGF -1R et IR, qui ont été structurellement caractérisés dans les formes non activées, non phosphorylées (0P), et complètement activées, triplement phosphorylées (3P) 21,22. Globalement, les structures de l’IGFR-0P non activé ressemblent étroitement à celles de l’IR-0P , ce qui est également vrai pour les formes pleinement actives IGFR-3P et IR-3P. Cependant, les formes inactivées et activées sont structurellement très distinctes les unes des autres, en particulier en ce qui concerne les positions de la boucle d’activation et de l’hélice. Dans une campagne de criblage à haut débit (HTS) de la collection Merck Serono contre IGF- 1R, le composé 1 s’est révélé inhiber l’enzyme (figure ​ (figure 1) .1). Bien que l’activité inhibitrice avec une CI50 de 10 μ M n’ait été que modérée, nous avons décidé de caractériser davantage ce coup. Des tests cellulaires ultérieurs dans un dosage immunoenzymatique phospho-IGF-1R (ELISA) ont révélé une valeur de CI50 de 18 μ M pour 1. Figure 1 Structure de l’HTS hit 1. Les structures de cette classe d’indolealkylamine sont connues pour se lier à G récepteurs couplés aux protéines dans le système nerveux central (SNC) avec une affinité nanomolaire. Ils ont déjà été montrés comme étant des liants très sélectifs du sous-type 1A du récepteur de la sérotonine et du transporteur de la réabsorption de la sérotonine, mais on ne savait pas que, outre leur activité sur le SNC, certains de ces composés inhibent également les protéines kinases. 1R.La structure chimique du hit de sélection 1 ne représente évidemment pas un motif typique de liaison charnière.24 Par conséquent, nous avons commencé avec l’expansion de la relation structure-activité (SAR) autour de ce hit (Tableau 1). Tableau 1 Activité biochimique et cellulaire La synthèse du bloc de construction 15 commence par l’acylation du 5-cyano-indole 13 avec du chlorure d’acide chloro-butyrique, et ensuite, le carbone de carbonyle est complètement réduit. avec un réactif complexe d’hydrure d’aluminium à 14. Le chlore est substitué avec de la 4- (BOC amino) pipéridine dans des conditions basiques, le groupe protecteur est clivé avec un acide, et l’amine libre 15 est soumise On a observé un gain de puissance significatif sur l’IGF-1R d’un facteur 4 en déplaçant la liaison de liaison amide sur l’anneau indole de position 6 (1, IC50 = 10 μ M) dans la position 7 (2, IC50 = 2,5 μ M). En accord avec cette tendance, bien que moins prononcée, était le dérivé 4-indolyle 3 (CI50 = 6,0 μ M), indiquant une certaine influence de la fixation angulaire de l’amide sur le cycle indole. Par conséquent, nous nous sommes concentrés sur les indoles 4- et 7-yl portant des substituants électro-attractifs et donneurs d’ions pour explorer davantage le SAR. Comme résumé dans le tableau 1, de légères modifications ont un impact dramatique sur la puissance des composés. La fixation de substituants donneurs d’électrons tels que méthyle (4, CI50 = 2,7 μ M) et éthyle (5, IC50 = 3,6 μ M) sur l’azote 4-indolyle a entraîné une nette réduction de l’inhibition en tant que comparé à l’indole non substitué 3. La diminution de la puissance a également été observée dans une sous-série de dérivés 7-indolyl avec substitution carbonyle en position 3. En comparaison avec le dérivé non substitué 2, on a observé une diminution de 3 fois de la puissance du méthyle (7, CI50 = 4,6 μ M) et du trifluorométhyle (8, IC50 = 4,0 μ ), de même que pour l’amide 9, tandis que l’aldéhyde, moins volumineux (6, IC50 = 0,9 μ M), était légèrement plus puissant. La tendance à une augmentation de l’activité biochimique par substitution électronucléaire en position 3 de l’indole a été confirmée avec les dérivés 3-cyano 10 (CI50 = 0,4 μ M) et 11 (IC50 = 0,2 μ M). Les deux composés présentaient une CI50 submicromolaire et étaient jusqu’à 50 fois plus puissants que le point de départ 1. En plus des propriétés électroniques, les aspects stériques des substituants indolyl avaient également une influence sur l’inhibition de l’IGF-1R. Ceci a été démontré avec l’isomère 3-cyanoindol-4-yl (IC50 = 3,5 μ M), qui est d’un facteur 18 moins actif que le 3-cyano-5-fluoro-indol-7 le plus puissant. molécule -yl (11). Néanmoins, l’optimisation biochimique réussie du criblage 1 nous a incités à analyser la série plus en détail. Les composés du tableau 1 ont été testés dans le test ELISA de capture pour évaluer leur activité inhibitrice sur la phosphorylation de IGF-1 induite par IGF-1 dans des cellules de cancer du sein MCF-7. Ces inhibiteurs de l’IGF-1R présentaient une activité cellulaire modérée avec des valeurs de CI50 allant de 2,2 à 40 ° C.Les inhibiteurs d’IGF-1R 12 ont également été testés dans des dosages d’enzyme recombinante et de récepteur de phospho-insuline kinase cellulaire (InsR) pour évaluer leur activité dans ce contexte. Dans le dosage enzymatique recombinant, tous les composés (sauf un) présentent une activité supérieure sur l’IGF-1R par des facteurs allant de 1,4 (7) à 23 (10). L’exception est le dérivé 4-indolyl non substitué 3 (qui montre une activité plus élevée sur l’InsR d’un facteur 6). Les dosages cellulaires mettent en évidence la sélectivité IGF-1R des composés. En comparaison avec les activités contre l’IGF-1R, tous les inhibiteurs ont démontré des valeurs cellulaires InsR IC50 supérieures à 30 μ M.26 Les dérivés les plus puissants 10 et 11 présentaient une différence d’activité contre l’IGF-1R et l’InsR par Pour caractériser davantage le mode de liaison de ces composés, 10 a été cocristallisé avec le domaine kinase de l’IGF-1R humain. La structure cristalline a été résolue à 1,8 Å et montre le repliement de kinase bilobal typique avec le lobe C-terminal hélicoïdal et le lobe N-terminal constitué de feuilles 5-brin β et de l’hélice α Sur la base des données publiées, une construction IGF-1R non phosphorylée contenant deux mutations (E1097A et E1099A) a été utilisée.27 Il y a quatre molécules dans l’unité asymétrique avec des conformations globales légèrement différentes. Des différences mineures existent principalement en ce qui concerne l’ouverture des lobes N- et C-terminaux, qui est en corrélation avec la conformation de la boucle d’activation flexible. En raison de cette flexibilité, certaines parties de la boucle d’activation sont désordonnées. La position de liaison du ligand est clairement définie dans la carte de densité électronique à l’exception du substituant 3-cyano indolyl carboxamide, qui a été inclus dans une conformation la plus raisonnable dans le modèle final, mais avec une occupation fixée à 0. Contrairement à d’autres publications Les inhibiteurs d’IGF-1R, 28, 2910 ne se lient pas dans le site de liaison d’ATP, mais dans une poche de liaison adjacente à côté du motif DFG et de la boucle d’activation (liaison de type III). Le cycle 5-cyano indole est pris en sandwich entre les chaînes latérales de Met 1054 et Met 1079 et reconnu via une liaison H entre l’indole NH et l’atome d’oxygène carbonyle de la chaîne principale de Val 1063 (Figure 22). Structure de 2 rayons X de 10 dans IGF-1R et description schématique des interactions de 10 avec le site de liaison allostérique IGF-1R.En outre, le groupe 5-nitrile se trouve dans la distance H-liaison à une molécule d’eau située dans le l’interface des chaînes latérales de Lys 1033 et Glu 1050 et le squelette carbonyle de Phe 1047. Ces résultats sont en accord avec l’activité d’autres criblages concernant l’importance de la fonctionnalité du donneur de NH indole et le rôle du nitrile30. La chaîne n-butyle forme des interactions de van der Waals avec les chaînes latérales de Met 1054, His 1133, Ile 1151 et Phe 1131. Sur le site opposé, la chaîne n-butyle est en contact avec un vaste groupe de molécules d’eau Deux molécules d’eau de ce cluster médient les liaisons H entre t Le N-atome de pipéridine et la chaîne latérale de Asp 1153. Mis à part les interactions de van der Waals avec His 1133, le noyau pipéridine est principalement entouré par le groupe de molécules d’eau susmentionné. Comme mentionné précédemment, le second cycle 3-cyano indole attaché n’est pas défini dans la carte de densité électronique, reflétée par une position déjà exposée à la surface de la protéine. Cependant, plusieurs acides aminés polaires (Arg 1134 et Asp 1135) et lipophiles (Leu 1174, Pro 1175, Phe 1189 et Tyr 1165) sont au voisinage de cet anneau indole distal, indiquant un degré d’influence de cette région sur la liaison de l’inhibiteur. comme on le voit dans la SAR.A superposition des structures cristallines de l’IGF-1R en complexe avec 10 et la structure apo de la forme non phosphorylée (PDB code 1P40) a révélé des changements conformationnels significatifs dans la boucle d’activation, en particulier en ce qui concerne Phe 1154 du motif DFG (“ Phe-out ”), mais seulement des changements modérés dans les positions relatives de la boucle GC et de l’hélice α C (figure ​ (figure3A) .3A). Ce “ Phe-out ” la conformation est similaire à la Phe 1151 correspondante dans la structure apo de l’InsR non phosphorylée (figure ​ (figure 3B) .3B). Cependant, la boucle GC et l’hélice C sont significativement repositionnées comme observé auparavant pour les structures apo IGF-1R-0P et InsR-0P.21 Les acides aminés interagissant directement avec 10 dans IGF-1R sont conservés dans InsR, mais le site de liaison de l’anneau indole de 10 est partiellement bloqué par Met 1051 et Met 1076. Ces différences conformationnelles entraînent des formes altérées des poches allostériques, ce qui pourrait expliquer la sélectivité observée de 1 − 12 contre InsR sur un niveau de dépistage cellulaire. . Ces informations détaillées sur le mode de liaison de 10 à IGF-1R sont utiles pour expliquer les résultats de notre travail de synthèse et donner des indications sur le mode d’action de ces inhibiteurs de l’IGF-1R allostérique.Figure 3 (A) Comparaison des structures de rayons X de 10 dans IGF-1R (magenta) avec la structure apo de IGF-1R non phosphorylé (gris foncé) a montré un ajustement induit de la boucle d’activation, y compris Phe 1154, mais seulement de légers changements concernant la boucle GC et α C … En conclusion, l’analyse structurelle du hit 10 (MSC1609119A-1) a révélé un mode de liaison allostérique, et les contacts contribuant aux acides aminés ont été identifiés. Le composé 11 d’IGF-1R biochimique le plus puissant est d’un facteur 50 plus puissant que le premier essai de dépistage 1. Les composés ont une activité cellulaire dans le test ELISA phospho-IGF-1R et, comme indiqué, n’influencent pas significativement la signalisation IR jusqu’à à des concentrations de 30 μ M. Ces hits et leur mode de liaison à IGF-1R pourraient servir de point de départ pour générer une sélectivité encore plus prononcée contre InsR.